昆虫细胞大规模培养和杆状病毒的生产

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此细胞系适用于InsectSelect系统。

这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。

（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。

贴壁紧。

标准条件的定义：培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。

活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。

贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。

形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。

确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。

Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。

细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。

Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。

此细胞系适用于InsectSelect系统。

这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。

（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。

贴壁紧。

标准条件的定义：培养最低密度：0.6/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。

活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。

贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。

形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×-2.5×细胞/mL后将密度调整至0.7×-1.0×细胞/mL进行悬浮传代。

确保传代细胞密度不高于4×个/mL或保持密度高于1×个/mL以达到对数生长状态。

Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。

细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。

当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。

1. 用细胞计数板计数细胞。

需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。

细胞可是悬浮或贴壁培养；2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；3. 室温400-600×g离心10min。

移除上清。

4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；7. 储存于液氮中。

动物细胞大规模培养技术培养流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。

昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。

将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。

杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。

杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。

昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。

因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。

昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。

细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。

而昆虫细胞表达系统具有很多优点：(1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统；(2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构；(3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；(4)昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。

高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；(5)可表达非常大的外源性基因（~200kD）而不至于影响本身的增殖；(6)具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；(7)通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因；(8)对脊椎动物是安全的，杆状病毒属于昆虫病毒，有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱，被认为是安全的载体。

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