杆状病毒表达系统昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定

杆状病毒表达蛋白1 donor vector的构建1.1 外源基因的连接1.2 转化1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。

1.2.2 冰浴30min。

1.2.3 42℃，90s。

1.2.4 马上放入冰浴中，2min。

1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。

（LB 37℃预热）1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。

1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。

1.3 鉴定1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。

1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。

1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。

1.3.4 取1ml菌液测序。

1.4 菌种的保存1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。

1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。

1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。

1.4.4 -80℃保存。

2 转座2.1 转座反应2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。

2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。

2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。

pFastBac TM construct 1ng(5μL)pFastBac TM control 1ngPUC19 control 50pg2.1.4于冰中放置30min。

2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。

2.1.6 马上放入冰浴中，2min。

2.1.7 加入900μL室温LB培养基。

2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。

2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。

（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911359260.7(22)申请日 2019.12.25(71)申请人 乾元浩生物股份有限公司地址 100068 北京市丰台区南四环西路188号总部基地11区20号楼(72)发明人 袁野　岳建新　王飞　孙灵睿　周蕾蕾　陈秋阁　向王震　张秀美　李浩鹏　李浩哲　朱昊敏　魏杰　安铁军　(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人 黄爽(51)Int.Cl.C12N 15/866(2006.01)(54)发明名称利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法(57)摘要本发明提供一种利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法。

利用本方法可进行悬浮细胞摇瓶培养及发酵罐生产。

对基于Sf9细胞悬浮培养技术的重组蛋白表达效果进行检测，目的蛋白可达到分泌型表达，无需细胞冻融及其复杂的纯化工艺。

本工艺简单，易放大，无需换液，仅使用一种培养基便能够达到细胞生长繁殖及蛋白表达的目的。

权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图2页CN 111019973 A 2020.04.17C N 111019973A1.利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统高效表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过Bac -to -Bac系统，构建包含编码重组蛋白DNA片段的重组穿梭质粒Bacmid，然后将重组穿梭质粒Bacmid与转染试剂混匀后转染悬浮培养的昆虫细胞，当细胞活率降至60-80％时收获培养上清，即为P0代重组杆状病毒；(2)用P0代重组杆状病毒接种摇瓶中悬浮培养的昆虫细胞，在转数130-150rpm，温度27±0.5℃条件下进行摇床培养，当≥90％的细胞发生明显病变并失去活力时，收获培养上清；接种时，细胞密度为2×106-4×106个/mL，装液量为摇瓶体积的1/4～1/3。

昆虫杆状病毒表达系统研究进展昆虫杆状病毒表达系统研究进展摘要：昆虫杆状病毒表达载体系统具有安全性好、重组蛋白表达量高、能同时表达多个基因、重组蛋白翻译后加工完整等特点，因而得到了广泛的应用。

随着重组杆状病毒构建技术的不断发展，昆虫杆状病毒表达载体系统的操作在逐渐简化，重组杆状病毒获得的效率也在不断提高。

昆虫细胞培养技术的改进和转基因昆虫细胞系的发展，进一步推动了昆虫杆状病毒表达载体系统在商品化药物、治疗性抗体、生物农药研发和基因治疗中的应用。

尽管仍存在着重组蛋白降解的问题，但随着分子生物学技术的发展，对杆状病毒载体的研究与改造也会更加深入，未来昆虫杆状病毒表达载体系统的应用将更为广泛。

关键词：杆状病毒；多角体启动子；转基因昆虫细胞系；疫苗；治疗性抗体。

前言作为当今基因工程四大表达系统之一，昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus ex． pression vector system，IC-BEVS)的应用变得越来越广泛。

它不仅具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点，且能同时在一个载体上表达多种蛋白。

由于昆虫细胞易于悬浮培养，细胞培养基的改进也使得悬浮培养的细胞活率不断提高，最终得以实现昆虫细胞的大规模培养，这使得其在商业领域如生物医药、农业、疫苗研发等方面均获得了广泛的应用[1]。

1 杆状病毒的分类与分子生物学杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属，病毒粒子呈杆状，是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的DNA病毒。

基因组DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 kb之间。

杆状病毒基因组可在昆虫细胞核复制和转录，DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，因其具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入而成为表达大片段DNA的理想载体。

其中，目前用作外源基因表达载体的杆状病毒主要为核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

Bac-to-bac中⽂说明书Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的⽅法产⽣重组杆状病毒。

此⽅法基于让已经转⼊杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座⼦的表达框的质粒在Ecoli中扩增。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产⽣包含⽬的位点的表达结构，这个⽬的基因的产⽣被杆状病毒特意位点启动⼦控制。

*⼀个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产⽣重组杆粒。

*⼀个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产⽣重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素⼄酰转移酶。

Bac-to-Bac表达系统的优点：使⽤这个系统产⽣重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使⽤同源重组产⽣重组杆状病毒所需的4-6周相⽐，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和⾮重组病毒的⼏率*可以快速同时进⾏⼤量重组，适合表达功能性研究的蛋⽩选择pFastBac菌体（Vector）：⼤量的pFastBac菌体都适于进⾏Bac-to-Bac表达系统。

选择对于你的需要最合适的菌体。

指南⽤途：指南提供了⼀个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆⽬的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最⾼效的DH10Bac TM产⽣重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆⾍细胞产⽣重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使⽤病毒株感染昆⾍细胞表达⽬的重组蛋⽩重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是⽤来帮助你产⽣重组杆状病毒，在昆⾍细胞中进⾏⾼⽔平表达⽬的基因的系统。

虽然他可以帮助你很容易的产⽣杆状病毒表达你的重组蛋⽩，但是使⽤这系统更倾向于有杆状病毒⽣物学和昆⾍表达背景的使⽤者。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。

此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。

*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。

*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。

Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。

选择对于你的需要最合适的菌体。

指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。

虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法摘要本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。

该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。

说明定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法技术领域[0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。

背景技术[0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。

杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白；[2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。

杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。

[0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。

杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具刘拂晓1,2 柳增善2 王志亮1【摘要】杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。

相对于其他表达系统，杆状病毒表达系统具有特殊的优势：杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因；杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋白的表达；昆虫细胞作为受体能够对外源蛋白进行加工修饰；杆状病毒通常只感染节肢动物，不会对人畜构成危害。

因此，该系统越来越受到人们的重视，并已应用于亚单位疫苗的研发与生产，特别其对于构建病毒样颗粒，即由一种或多种病毒结构蛋白自行装配而成且不含病毒基因组的蛋白颗粒，具有不可比拟的优势。

对此做详细评述并展望病毒样颗粒疫苗的发展趋势。

【期刊名称】生物技术通报【年(卷),期】2012(000)006【总页数】7【关键词】杆状病毒昆虫细胞病毒样颗粒杆状病毒表达系统疫苗1983年，Smith等［2］成功实践了美国学者Miller的提出的杆状病毒作为载体在昆虫细胞中表达外源基因的可行性理论：他们将干扰素基因插入至苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californi-ca nuclear polyhedrosis virus，AcNPV）表达载体，然后将其转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf）细胞，成功表达了具有生物活性的人β干扰素。

此后，杆状病毒蛋白表达技术逐步建立并完善起来。

相对于传统大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞蛋白表达技术，杆状病毒技术在病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）的构建及应用方面具有不可比拟的优势。

VLP是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，高度模仿真实病毒的衣壳空间构象而不含其基因组。

大多数VLP 是良好的免疫原，既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫［3-5］。

随着杆状病毒蛋白表达技术的成熟，利用其构建VLP的报道也屡见不鲜。

1 杆状病毒分子生物学根据国际病毒分类委员会最新病毒分类报告，杆状病毒科（Baculoviridae）分为4个属，即α杆状病毒属（Alphabaculovirus）、β杆状病毒属（Betabaculovirus）、δ杆状病毒属（Deltabaculovirus）、γ杆状病毒属（Gammabaculovirus）。

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.10.23C N 103364560 A (21)申请号 201310309787.5(22)申请日 2013.07.23G01N 33/577(2006.01)G01N 33/569(2006.01)(71)申请人武汉中博生物股份有限公司地址430070 湖北省武汉市东湖开发区珞狮南路517号(72)发明人李晶梅 朱薇 温文生 漆世华谢红玲 靖志强 李建 秦红刚廖园园(74)专利代理机构武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222代理人张火春(54)发明名称一种测定杆状病毒滴度的方法(57)摘要本发明公开了一种测定杆状病毒滴度的方法，该方法包括如下步骤：将对数生长期的昆虫细胞以2×104～4×104/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养；弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察；计算病毒的TCID 50。

本发明测定杆状病毒滴度的方法结合了间接免疫荧光，是一种直接判定各孔细胞是否感染的TCID 50测定方法，重复性好，得到的检测结果更为准确，不需要结合细胞病变来进行判断，没有主观和经验因素的影响。

(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书5页 附图2页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页 附图2页(10)申请公布号CN 103364560 A*CN103364560A*1/1页1.一种测定杆状病毒滴度的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）昆虫细胞板的制备：将对数生长期的昆虫细胞以2×104～4×104/0.1mL/孔的细胞密度铺到细胞培养板中，置培养箱中培养使昆虫细胞贴于孔底；（2）接种杆状病毒：将被检的杆状病毒接种到昆虫细胞板中于培养箱中培养；（3）间接免疫荧光确定被感染的细胞孔数：弃去细胞板内培养基，固定，洗细胞板，加入gp64单抗孵育，洗细胞板，再加入羊抗鼠荧光抗体孵育，洗细胞板，荧光显微镜下观察，细胞膜显示亮绿色荧光判定该细胞所在孔为阳性孔；（4）病毒滴度计算：计算病毒的TCID50。