杆状病毒介绍
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实验材料:1. 重组杆状病毒质粒:Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT,已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司,CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤:一、昆虫细胞转染:1. Sf9细胞计数,取6孔板中的两孔,每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照),并以全培培养至少1小时,使细胞贴壁。
2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物:a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium,混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀,室温孵育20min。
3.重组质粒与转染剂混合液孵育的同时,以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4.取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中,轻轻混匀后,总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中,27℃继续培养5h。
5.移除质粒、转染剂混合物,加入2ml全培。
27℃湿盒孵育,直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备:1. 病毒感染晚期(正常24-72h)可见细胞停止生长、黏附,呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清,500g离心5min,去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液,移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增,按以下公式进行所需病毒P1贮液的量:感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注:若不进行病毒空斑测定,P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下:a. 转染当天,取2×106个细胞/孔加入六孔板中,贴壁生长至少1h。
杆状病毒介绍杆状病毒关键词:昆虫病毒,杆状病毒,核型多角体病毒,颗粒体病毒,质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒,病毒粒子呈杆状,基因组为双链环状DNA分子,DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内,大小在90~180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现600多种杆状病毒,但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子,大小为80~160 kb,其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内,后者具有较大的柔韧性,可容纳较大片段的外源DNA插入,因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中,用作外源基因表达载体的杆状病毒,目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒,呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式:一种为包含体病毒(occluded virus,OV),另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus,BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同,包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式,昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即为29 000的多角体蛋白,它对病毒的水平感染起以下作用:①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放,引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5),可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式,由细胞芽生出BV,进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年,有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速,其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒基因转导的技术和应用随着科学技术的不断进步,人类对基因的认识和应用也逐渐深入。
在基因工程领域,杆状病毒基因转导技术是一种十分有前途的技术。
本文将介绍杆状病毒的基本情况、杆状病毒基因转导技术的原理和应用。
一、杆状病毒的基本情况杆状病毒是一种单链RNA病毒,是植物病毒中最重要的一种。
它可以侵入植物细胞内部,通过自身的基因组合成一种非常具有活力的蛋白质,然后传递给其他细胞。
由于其生物学特性,许多疾病和社会问题一直没有得到很好的解决。
因此,了解杆状病毒的基本情况是基因转导技术研究的重要前提。
二、杆状病毒基因转导技术的原理杆状病毒基因转导技术是将外源DNA引入植物细胞中的一种方法。
一般来说,它是通过将带有目的基因的载体构建成病毒载体,然后通过感染植物细胞来实现目标基因的转录和翻译的。
在这个过程中,载体的构建是很关键的。
一般来说,载体需要包括一个病毒颗粒功能区、一个基因组合成的目标DNA功能区和一个表达基因的启动子区。
通过这三个功能区的合成,我们就可以得到病毒颗粒,进而实现基因转导。
三、杆状病毒基因转导技术的应用杆状病毒基因转导技术的应用非常广泛,在基因工程、生物学研究和生产过程中都有非常重要的作用。
以下是几个常见的应用领域:1. 植物基因研究杆状病毒基因转导技术可以用于植物基因的研究和功能分析。
通过这种方法,可以快速有效地将外源基因引入植物细胞,研究它们的表达和功能等方面的问题。
这能够提高我们的基因研究的精度和效率,也可以为我们了解植物的种类和特性提供有用的信息。
2. 植物基因工程杆状病毒基因转导技术还可以用于植物的基因工程领域。
通过这种方法,我们可以有效地转化作物和一些经济植物,从而对其进行基因编辑和优化。
这有助于我们提高作物产量、提高经济效益、改善植物的品质,为人们生活和经济发展做出贡献。
3. 疫苗生产杆状病毒基因转导技术也可以用于疫苗的生产。
一些病原体所带有的代谢基因、毒力基因等,可以被杆状病毒转导载体所调控,然后被表达出来。
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞,它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定,但是表达基因的相对分子质量有限,不宜过大,且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性,日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现600多种杆状病毒,但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子,大小为80~160 kb,其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内,后者具有较大的柔韧性,可容纳较大片段的外源DNA插入,因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中,用作外源基因表达载体的杆状病毒,目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒,呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式:一种为包含体病毒(occluded virus,OV),另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus,BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同,包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式,昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即为29 000的多角体蛋白,它对病毒的水平感染起以下作用:①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放,引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5),可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式,由细胞芽生出BV,进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年,有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速,其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统(BEVS)●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。
2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态:一种为出芽型病毒(budded virus, BV),另一种为包含体病毒(Occlusion‐derived virus, OV)。
3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。
4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。
5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。
6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期●早期(0‐6h PI)•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期(6‐24h PI)•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核,随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽,主要是多角体蛋白,形成包含体病毒。
多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。
缺乏蛋白质翻译后加工机制;目的蛋白不可溶,蛋白生物活性低。
酵母表达量高,可以翻译后加工,易实现高密度发酵。
蛋白质量不理想。
哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。
成本高;表达水平低,技术和环境要求高。
昆虫细胞重组蛋白生物学活性高;表达水平高;能同时表达多个基因。
重组蛋白糖基化程度低。
杆状病毒及其持续性感染细胞的研究现状及展望黄磊(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳550001)摘要:杆状病毒(Baculovirus)是一类专一性寄生于节肢动物,且具囊膜包被的双链闭环DNA病毒,是一种具有潜力的生物杀虫剂,也是生态系统的一个组成部分,是调节昆虫种群密度大小的重要病原因子。
了解杆状病毒持续性感染细胞的研究现状,对后续研究病毒-宿主关系、杆状病毒的持续感染及激活的机制、利用杆状病毒作为真核表达载体、开发杆状病毒应用于农林业病虫害防治、控制昆虫种群密度等方面具有重要意义。
关键词:杆状病毒;病毒的持续性感染;现状及展望Baculovirus And Baculovirus Persistent Infection Cells Status AndProspectsHuang Lei(School of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China) Abstract: Baculovirus are a class of specific parasitic arthropods, and capsular bag closed by a double-stranded DNA virus. It is a potential of the bio-pesticides, is an integral part of the ecosystem, also the important etiologic agent to regulation of insect population density size. Understanding Baculovirus persistent infected cells research status, on the follow-up study the relationship of virus-host ,the baculovirus persistent infection and activation mechanisms, use baculovirus as a eukaryotic expression vector, and develop baculovirus to use in pest control of agroforestry, as well as control insect population density and other aspects of great significance. Key words: Baculovirus;Baculovirus persistent infection; research status and prospects 杆状病毒专一性寄生于节肢动物,对人类和环境安全,且昆虫一般不产生抗性,因而在害虫治理中受到极大关注[1]。
杆状病毒关键词:昆虫病毒,杆状病毒,核型多角体病毒,颗粒体病毒,质型多角体病毒杆状病毒就是一类在自然界中专一性感染节肢动物得DNA病毒,病毒粒子呈杆状,基因组为双链环状DNA分子,DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内,大小在90~180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现600多种杆状病毒,但进行分子生物学研究得不到20种。
杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链DNA 分子,大小为80~160 kb,其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。
DNA复制后组装在杆状病毒得核衣内,后者具有较大得柔韧性,可容纳较大片段得外源DNA 插入,因此就是表达大片段DNA得理想载体。
其中,用作外源基因表达载体得杆状病毒,目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m得包含体病毒,呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式:一种为包含体病毒(occluded virus,OV),另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus,BV)。
它们在病毒感染中扮演得角色不同,包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形式,昆虫往往就是食入污染OV得食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即为29 000得多角体蛋白,它对病毒得水平感染起以下作用:①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当得位置释放,引起感染。
昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10、5),可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒就是个体内细胞间得感染形式,由细胞芽生出BV,进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年,有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速,其中研究最深入得就是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒介绍杆状病毒关键词:昆虫病毒,杆状病毒,核型多角体病毒,颗粒体病毒,质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒,病毒粒子呈杆状,基因组为双链环状DNA分子,DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内,大小在90~180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现600多种杆状病毒,但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子,大小为80~160 kb,其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内,后者具有较大的柔韧性,可容纳较大片段的外源DNA插入,因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中,用作外源基因表达载体的杆状病毒,目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒,呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式:一种为包含体病毒(occluded virus,OV),另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus,BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同,包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式,昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即为29 000的多角体蛋白,它对病毒的水平感染起以下作用:①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放,引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5),可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式,由细胞芽生出BV,进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年,有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速,其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒多角体病多角体病毒,颗粒体病毒,质型关键词:昆虫病毒,杆状病毒,核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒,感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内,大DNA DNA分子,状,基因组为双链环状之间。
目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90~多种杆状病毒,600 杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现用于害虫防治。
DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。
复制后组DNA,其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。
分子,大小为80~160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内,后者具有较大得柔韧性,可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中,DNA得理想载体。
插入,因此就是表达大片段。
该NPV)(nuclear polyhedrosis virus,状病毒,目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒,1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。
核型多角体病毒有两种形式:,,OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。
,另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同,包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋式,昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白,它对病毒得水平感染起以下作用:①保护白晶体,即为29 000②保证病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。
,可使病毒、5)得位置释放,引起感染。
昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒就是个体内细胞间得感染形式,由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV BV,进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。
生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速,其中研究近几十年,最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞,它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定,但是表达基因的相对分子质量有限,不宜过大,且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性,日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现600多种杆状病毒,但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子,大小为80~160 kb,其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内,后者具有较大的柔韧性,可容纳较大片段的外源DNA插入,因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中,用作外源基因表达载体的杆状病毒,目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒,呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式:一种为包含体病毒(occluded virus,OV),另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus,BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同,包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式,昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即为29 000的多角体蛋白,它对病毒的水平感染起以下作用:①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放,引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5),可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式,由细胞芽生出BV,进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年,有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速,其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒介绍杆状病毒关键词:昆虫病毒,杆状病毒,核型多角体病毒,颗粒体病毒,质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒,病毒粒子呈杆状,基因组为双链环状DNA分子,DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内,大小在90~180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现600多种杆状病毒,但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子,大小为80~160 kb,其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内,后者具有较大的柔韧性,可容纳较大片段的外源DNA插入,因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中,用作外源基因表达载体的杆状病毒,目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒,呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式:一种为包含体病毒(occluded virus,OV),另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus,BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同,包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式,昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即为29 000的多角体蛋白,它对病毒的水平感染起以下作用:①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放,引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5),可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式,由细胞芽生出BV,进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年,有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速,其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。