杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)

如何提高FuGENE HD转染实验成功率FuGENE, 转染摘要：在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。

在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。

【组织培养试剂】一般提示：优化您的细胞生长条件。

只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。

基础培养基—目前所使用的各种市售培养基（如，RPMI 1640和DMEM）。

培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。

有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。

务必要使培养基避光保存。

因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。

酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES降解所产生的毒性效应，但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下，如荧光素酶的测定，细胞毒性则仍然是一个问题。

胎牛血清—血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。

采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。

因此血清易受显著生物学变异的影响。

添加剂—某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。

CO2培养箱—细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95％的CO2培养箱。

用CO2是为了控制pH值。

细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。

有些培养基需要CO2 浓度为5％来有效控制pH值，而另一些则需要10％的CO2。

需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。

如果培养箱内培养条件与所需条件不一致（温度、湿度和CO2）则会导致实验结果的板间变异性。

来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌／细胞的污染也都可能影响到细胞生理【细胞】一般提示：密切观察您的细胞；确保它们状态良好。

Bac-to-bac中⽂说明书Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的⽅法产⽣重组杆状病毒。

此⽅法基于让已经转⼊杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座⼦的表达框的质粒在Ecoli中扩增。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产⽣包含⽬的位点的表达结构，这个⽬的基因的产⽣被杆状病毒特意位点启动⼦控制。

*⼀个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产⽣重组杆粒。

*⼀个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产⽣重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素⼄酰转移酶。

Bac-to-Bac表达系统的优点：使⽤这个系统产⽣重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使⽤同源重组产⽣重组杆状病毒所需的4-6周相⽐，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和⾮重组病毒的⼏率*可以快速同时进⾏⼤量重组，适合表达功能性研究的蛋⽩选择pFastBac菌体（Vector）：⼤量的pFastBac菌体都适于进⾏Bac-to-Bac表达系统。

选择对于你的需要最合适的菌体。

指南⽤途：指南提供了⼀个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆⽬的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最⾼效的DH10Bac TM产⽣重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆⾍细胞产⽣重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使⽤病毒株感染昆⾍细胞表达⽬的重组蛋⽩重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是⽤来帮助你产⽣重组杆状病毒，在昆⾍细胞中进⾏⾼⽔平表达⽬的基因的系统。

虽然他可以帮助你很容易的产⽣杆状病毒表达你的重组蛋⽩，但是使⽤这系统更倾向于有杆状病毒⽣物学和昆⾍表达背景的使⽤者。

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。

原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。

真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。

昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。

1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。

杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。

DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。

其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。

包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。

原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。

真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。

昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。

1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。

杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。

DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。

其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。

该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。

它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。

包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。

此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。

*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。

*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。

Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。

选择对于你的需要最合适的菌体。

指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。

虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。

杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具刘拂晓1,2 柳增善2 王志亮1【摘要】杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。

相对于其他表达系统，杆状病毒表达系统具有特殊的优势：杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因；杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋白的表达；昆虫细胞作为受体能够对外源蛋白进行加工修饰；杆状病毒通常只感染节肢动物，不会对人畜构成危害。

因此，该系统越来越受到人们的重视，并已应用于亚单位疫苗的研发与生产，特别其对于构建病毒样颗粒，即由一种或多种病毒结构蛋白自行装配而成且不含病毒基因组的蛋白颗粒，具有不可比拟的优势。

对此做详细评述并展望病毒样颗粒疫苗的发展趋势。

【期刊名称】生物技术通报【年(卷),期】2012(000)006【总页数】7【关键词】杆状病毒昆虫细胞病毒样颗粒杆状病毒表达系统疫苗1983年，Smith等［2］成功实践了美国学者Miller的提出的杆状病毒作为载体在昆虫细胞中表达外源基因的可行性理论：他们将干扰素基因插入至苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californi-ca nuclear polyhedrosis virus，AcNPV）表达载体，然后将其转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf）细胞，成功表达了具有生物活性的人β干扰素。

此后，杆状病毒蛋白表达技术逐步建立并完善起来。

相对于传统大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞蛋白表达技术，杆状病毒技术在病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）的构建及应用方面具有不可比拟的优势。

VLP是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，高度模仿真实病毒的衣壳空间构象而不含其基因组。

大多数VLP 是良好的免疫原，既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫［3-5］。

随着杆状病毒蛋白表达技术的成熟，利用其构建VLP的报道也屡见不鲜。

1 杆状病毒分子生物学根据国际病毒分类委员会最新病毒分类报告，杆状病毒科（Baculoviridae）分为4个属，即α杆状病毒属（Alphabaculovirus）、β杆状病毒属（Betabaculovirus）、δ杆状病毒属（Deltabaculovirus）、γ杆状病毒属（Gammabaculovirus）。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。

此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。

*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。

*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CA T基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。

Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。

选择对于你的需要最合适的菌体。

指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。

虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。

昆虫杆状病毒表达系统研究进展昆虫杆状病毒表达系统研究进展摘要：昆虫杆状病毒表达载体系统具有安全性好、重组蛋白表达量高、能同时表达多个基因、重组蛋白翻译后加工完整等特点，因而得到了广泛的应用。

随着重组杆状病毒构建技术的不断发展，昆虫杆状病毒表达载体系统的操作在逐渐简化，重组杆状病毒获得的效率也在不断提高。

昆虫细胞培养技术的改进和转基因昆虫细胞系的发展，进一步推动了昆虫杆状病毒表达载体系统在商品化药物、治疗性抗体、生物农药研发和基因治疗中的应用。

尽管仍存在着重组蛋白降解的问题，但随着分子生物学技术的发展，对杆状病毒载体的研究与改造也会更加深入，未来昆虫杆状病毒表达载体系统的应用将更为广泛。

关键词：杆状病毒；多角体启动子；转基因昆虫细胞系；疫苗；治疗性抗体。

前言作为当今基因工程四大表达系统之一，昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus ex． pression vector system，IC-BEVS)的应用变得越来越广泛。

它不仅具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点，且能同时在一个载体上表达多种蛋白。

由于昆虫细胞易于悬浮培养，细胞培养基的改进也使得悬浮培养的细胞活率不断提高，最终得以实现昆虫细胞的大规模培养，这使得其在商业领域如生物医药、农业、疫苗研发等方面均获得了广泛的应用[1]。

1 杆状病毒的分类与分子生物学杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属，病毒粒子呈杆状，是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的DNA病毒。

基因组DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 kb之间。

杆状病毒基因组可在昆虫细胞核复制和转录，DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，因其具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入而成为表达大片段DNA的理想载体。

其中，目前用作外源基因表达载体的杆状病毒主要为核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus，NPV)。