八、检测口蹄疫病毒抗原的方法

2019年第7期 吉林畜牧兽医·经验交流·JingYan JiaoLiu口蹄疫病毒抗体检测白 翠，王 楠，王 晶，马晓媛，于钦磊吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062摘 要：口蹄疫是一种急性、高度接触性、烈性的传染病，是由口蹄疫病毒引起的，常常发生在偶蹄动物，偶尔也见于人和其它动物。

世界动物卫生组织已经将该病列为法定申报传染病，我国将其列为一类动物疫病。

我国主要通过实施强制免疫来预防控制该病，疫苗免疫之后所产生的抗体水平是评价免疫效果的重要手段，也可以根据免疫后的 效果来制定合理免疫程序。

本实验室主要通过口蹄疫液相阻断和3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒来进行抗体检测。

关键词：口蹄疫；ELISA；抗体检测我国口蹄疫病毒流行毒株主要为A型、亚洲I型和O型，其中O型口蹄疫病毒基因型众多，流行广泛，严重危害畜牧养殖业发展[1]。

1 液相阻断ELISA方法进行抗体检测液相阻断是应用双抗体夹心法，其试验过程是抗原吸附在载体上，也就是我们常说的包被，包被后加入待测抗体，反应后加相应酶标记抗体，生成抗原抗体复合物，再与底物发生显色反应。

最后通过酶标仪的光谱吸收，测量OD值，计算抗体的量。

本实验室的试剂盒主要是使用兰州兽医研究所（兰兽研）研制开发的，该试剂盒与其它同类型试剂盒相比，许多项指标都已达到了世界口蹄疫参考实验室的同类产品水平，符合率极高。

液相阻断的难点重点在于被检血清的稀释倍数，这个在试剂盒说明书上有具体操作步骤，实验室操作人员可根据说明书进行10份或20份样品的操作。

2 3ABC非结构蛋白抗体检测经抗原纯化过的口蹄疫疫苗，去除了绝大部分3ABC非结构蛋白[2]，因此，用灭活疫苗免疫的健康动物体内正常不会有3ABC非结构蛋白抗体产生，而自然感染的动物体内由于免疫频率的增加和免疫剂量的加大，不仅产生了结构蛋白而且也产生3ABC非结构蛋白抗体。

所以，用该方法可以区分自然感染和免疫抗体。

O型口蹄疫正向间接血凝抗原使用说明书一、原理用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。

若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。

这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。

二、适用范围主要用于检测O型口蹄疫免疫动物血清抗体效价。

三、试验器材1、96孔1100V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板2、微量移液器（50微升25微升）取液塑咀3、微量震荡器4、O型口蹄疫血凝抗原5、O型口蹄疫阴性对照血清6、O型口蹄疫阳性对照血清7、稀释液8、待检血清（每头约0.5ml血清即可）56℃水浴灭活30分钟四、试验方法1、加稀释液在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀释液50微升。

2、稀释待检血清取1号待检血清50微升加入第1排第1孔，并将塑咀插入孔底，右手拇指轻压弹簧3-4次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔……直至第9孔混匀后取出50微升丢弃。

此时第1排1-9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2(1)、1:4(2) 、1:8(3) 、1:16(4) 、1:32(5) 、1:64(6) 、1:128(7) 、1:256(8) 、1:512(9)。

取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排……均按上法稀释，注意：每取一份血清时，必须更换塑咀一个。

3、稀释阴性对照血清在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50微升，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。

此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2-1:16。

第6-7孔为稀释液对照。

4、稀释阳性对照血清在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50微升，对倍稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。

口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，FMD）是由小RNA病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、热性、烈性、高度接触性动物传染疫病，具有宿主范围广、传播快、危害巨大等特点，位居世界动物卫生组织（OIE）规定的A类动物疫病之首，我国也列为一类动物疫病，对畜牧业发展和公共食品安全危害巨大。

目前绝大多数国家和地区仍然采取以灭活疫苗免疫为主的防控措施，所以有效抗原含量的高低直接决定口蹄疫疫苗的品质和免疫后特异性抗体水平的高低。

口蹄疫疫苗的生产环节必须严格遵守药品生产质量管理规范（GMP）标准对各个生产工艺环节实行全程追踪，包括细胞密度与活力、病毒的接种与收获、灭活、浓缩纯化、乳化与分装等，对于口蹄疫抗原含量的检测分为生产过程中的检测及成品疫苗抗原量的监督控制。

目前，国外对于疫苗品质的评判主要是检测疫苗的PD50，鉴于我国对口蹄疫采取国家强制免疫的防控措施，每年检测口蹄疫疫苗PD50所需要的靶动物量较大，并且符合PD50检测需要的靶动物也比难购买，因此迫切需要建立一种能高效批量检测口蹄疫灭活疫苗生产中有效抗原含量的实验室检测技术，实时对疫苗生产各环节抗原含量进行有效监控，建立与疫苗效力检验PD50的相关性，切实为加快我国对口蹄疫的防控与净化保驾护航。

目前，对于口蹄疫灭活疫苗抗原含量检测的技术包括以下几种：一酶联免疫吸附技术（ELISA）主要是采用双抗体夹心法进行检测，首先使用纯化的口蹄疫病毒抗原免疫BALB/C小鼠，取抗体效价到达要求的小鼠脾脏分离脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）经PEG-4000进行细胞融合，并利用有限稀释法进行3-5次亚克隆，筛选出阳性值高、分泌稳定且特异性强的杂交瘤细胞株扩大培养并及时冻存，大量制备腹水型单克隆抗体并进行纯化，利用抗体亚型鉴定试剂盒对收集的腹水型单抗进行亚型鉴定，利用间接免疫荧光技术（IFA）对制备的单克隆抗体进行验证，同时建立病毒抗原与腹水型单抗之间的线性关系。

2016年福建高职招考生物模拟试题:胚胎工程【试题内容来自于相关网站和学校提供】1：人工获得胚胎干细胞的方法是：将细胞核移植到去核的卵细胞中，经过一定的处理使其发育至某一时期，从而获得胚胎干细胞。

“某一时期”最可能是A、受精卵B、囊胚C、八细胞胚D、原肠胚2：下列关于哺育动物胚胎发育和胚胎工程的叙述,正确的是（）A、原肠胚的三胚层逐渐分化形成各种器官原基B、在囊胚期，滋养层细胞发育成胚胎的附属结构C、在胚胎移植时受体母畜必须经过免疫学检验以防止排斥外来胚胎D、囊胚外表面的一层扁平细胞不断增殖分化，发育成的胚胎3：排卵的有关叙述正确的是（）A、牛排卵时排出的是初级卵母细胞B、精子与卵子受精后发生排卵C、排卵时已完成减数分裂，因此，排出的卵子仅含体细胞一半的遗传物质D、排卵后卵子进入输卵管，准备与精子受精4：高三学生小明最近到医院体检，体检报告中的肝功能检验结果显示：乙肝抗原呈阴性(－)，乙肝抗体呈阳性(＋)。

他说自己没有注射过乙肝疫苗，就此结果向你咨询，你应该给他怎样的合理建议(说明：“＋”表示有，“－”表示没有（）A、你体内带有乙肝抗体，说明一定也有乙肝病毒，需要到医院就诊B、你体内没有乙肝病毒，但含有乙肝抗体，一定是妈妈怀孕时传递给你的免疫力C、你体内没有乙肝病毒，但含有乙肝抗体，说明你可能曾感染乙肝病毒后痊愈了D、你体内没有乙肝病毒，但含有乙肝抗体，这是父母遗传给你的免疫力5：下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，正确的是（）A、卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加B、胚胎分割时需将原肠胚的内细胞团均等分割C、胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点D、胚胎干细胞是一类未分化细胞，可从早期胚胎中分离获取6：（2013福建理综）克隆猪成功率较低，与早期胚胎细胞的异常凋亡有关。

Bcl-2基因是细胞凋亡抑制基因，用PCR 技术可以检测该基因转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。

实验报告口蹄疫诊断实验报告：口蹄疫诊断摘要：口蹄疫是一种严重危害牲畜健康的疾病，及时准确的诊断对于控制疫情的蔓延至关重要。

本实验旨在探讨口蹄疫的诊断方法，并评估其准确性和可行性。

通过实验结果的分析，我们可以得出口蹄疫的诊断方法及其在疫情控制中的重要性。

引言：口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的急性传染病，主要影响牛、羊、猪等偶蹄类动物。

该疾病在全球范围内广泛流行，给畜牧业造成了严重的经济损失。

及时准确地诊断口蹄疫对于控制疫情的蔓延至关重要。

目前，常用的口蹄疫诊断方法包括病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等。

然而，这些方法在实际应用中存在一定的局限性，因此需要进一步研究和改进。

材料与方法：本实验选取了一批可能感染口蹄疫的动物样本，包括血清、组织和病毒等。

采用了病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法对这些样本进行分析，并比较了它们的准确性和可行性。

结果：通过实验分析，我们发现病毒学检测方法对口蹄疫的诊断具有较高的准确性，但需要较长的检测周期。

血清学检测方法具有快速、简便的优点，但其准确性相对较低。

分子生物学检测方法在口蹄疫诊断中表现出了较高的敏感性和特异性，是一种较为可靠的诊断方法。

讨论：口蹄疫的诊断方法是口蹄疫防控工作中的关键环节，不同的诊断方法各有优劣。

病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法可以相互补充，提高口蹄疫的诊断准确性和可行性。

在口蹄疫的防控工作中，应根据具体情况选择合适的诊断方法，并不断改进和完善口蹄疫的诊断技术。

结论：口蹄疫的诊断方法对于口蹄疫的防控具有重要意义。

病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法在口蹄疫的诊断中都具有一定的优势和局限性，需要综合考虑并不断改进完善。

口蹄疫的诊断技术的进步将为口蹄疫的防控工作提供重要的支持和保障。

一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。

现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。

1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。

病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。

中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。

病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。

2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。

灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。

当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。

然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。

中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。

2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。

目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。

硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。

652017.10·近年来，基于牛羊口蹄疫的严重危害，我国已经将其列入强制免疫的范围，因此，能否及时做好免疫抗体的效价检测不仅仅是关系到能够做好免疫质量评价的关键，同时也是关系到能否为牛羊口蹄疫免疫提供科学依据的关键。

但是，在实际工作中，由于所采用的抗体检测方法不同，往往会导致检测的结果呈现出一定的差异性，因此科学选择抗体检测方法尤为重要。

正向间接血凝实验和液相阻断可以说是2种常用的抗体检测方法。

为此，通过平行对比检测试验的方法对2种检测手段进行分析。

1 材料与方法1.1 被检测血清检测血清采用随机抽取的方法，主要来源就是已经成功注射牛羊o型-亚洲I型口蹄疫双价灭活疫苗的牛血液样品与羊血液样品，建议在21d左右的时间进行血样提取，在完成血清的分离后，将待检血清置于4℃左右的冰箱保存。

1.2 关于诊断试剂所选用诊断试剂为同一生产批号的口蹄疫O型正向血凝抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液以及O型口蹄疫液相阻断ELISA检测试剂盒。

1.3 关于检测方法及结果的判定正向间接血凝试验一定要严格按照说明进行操作，如果抗体的效价高于1：32的话，即可视抗体为合格；同样，O型口蹄疫液相阻断也要严格按照说明进行操作，在结果的判定方面我们通常是将病毒抗原对照的平均OD值的一半为临界值，也就是参考值，如果被检血清的OD值高出临界值，那么为阴性孔，如果低于临界值，就为阳性孔，需要注意的是，阳性孔的最高稀释度就是血清的抗体效价，如果高于1：64的话，我们可以认为抗体合格。

2 结果通过正向间接血凝检测，发现抽取的牛羊样本中，口蹄疫的免疫合格率分别为81.9%和83.67%，也就是说在所抽取的105头牛和98只羊中，分别有86头和82只羊的抗体检测是合格的。

3 结果分析从检测的实际结果来看，无论是正向间接血凝检测，还是液体阻断检测，结果是基本相符合的，也就是说对于同一批血清的检测抗体效价来说，具有显著的对应关系、任何一种检测方法敏感性和特异性低相对显著，试验结果科学、可靠。

【动科前沿】⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫诊断检测技术正在不断改进和创新，已从细胞培养、⾎清学诊断技术扩展到分⼦⽣物学诊断技术领域。

这些新技术不仅敏感、特异、⽽且简便、快速、经济、⾼通量化。

⼀、病原学检测技术1新的敏感细胞系因⽜甲状腺原代细胞和羔⽺原代细胞在⽣产上存在问题，尤其是很少进⾏⼝蹄疫诊断的实验室及因⼝蹄疫呈地⽅流⾏性的地区，很难得到⼝蹄疫阴性的动物。

⽽现有的细胞系对⼝蹄疫敏感性存在局限性，因此，研究者对⼝蹄疫毒更加敏感的细胞系的进⾏了研究。

Brehm等建⽴了⾼敏感⼭⽺胎⼉细胞系，结果表明，在分离7个⾎清型的⼝蹄疫病毒更加敏感。

并且该细胞还可以分离猪⽔泡病毒和⽔疱性⼝炎病毒。

LaRocco(2013)年将αv亚基和β6亚基同时导⼊到⽜肾细胞系中构建稳定表达细胞系LFBK-αvβ6,结果表明β6亚基⾄少在100代可以稳定表达，且增强了对⼝蹄疫病毒的易感性。

2分⼦⽣物学诊断技术2.1环介导转录等温扩增技术⼝蹄疫的传统诊断⽅法是由特异性病毒抗原的酶联免疫吸附试验检测所介导的，通过观察细胞培养中的病变效应。

另外，常规反转录聚合酶式反应和实时定量聚合酶式反应⽤来补充⼝蹄疫病毒感染的最初诊断⽅法。

然⽽，这些检测⽅法⽐较费⼒，并且需要昂贵的试验室设备。

为解决这些问题，Yamazaki等⼈建⽴了⼀个简单、快速和实⽤的反转录的环介导等温扩增⽅法鉴定动物及其产物中的⼝蹄疫病毒。

反转录环介导等温扩增⽅法⾸先是由Notomi等⼈报道的，并且成功应⽤于许多病毒的检测，李健等利⽤环介导等温扩增技术建⽴了⼝蹄疫快速检测⽅法，同时评价了该⽅法的灵敏性和特异性。

该检测⽅法检测体系具有极⾼的特异性，只能检测到⽬标病毒，与其他类病毒物较差反应，灵敏性较⾼。

2.2实时荧光定量反转录聚合酶链式反应荧光实时定量聚合酶链式反应就是通过对聚合酶链式反应扩增反应中的每⼀个循环产物荧光信号的实时监测，从⽽实现对起始模板定量及定性分析。

二、实验前准备



1、使用前，试剂 盒所有组份应回复 到18-26℃，试剂 要混合均匀，每个 样品使用一个吸头。 2、浓缩洗涤液用 蒸馏水或去离子水 25倍稀释。
三、实验操作步骤

1、抗原抗体反应布板
图 2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图
S1 1:32 1:64 1:128 1:256 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 1:64 1:128 1:256 -1:4 1:8



4、温育设备要精确度要高，温度过高过 低都会影响OD值高低。 5、包被板反应时严禁堆叠放置，应平铺 且板间有间隙，切不可离箱壁太近。 6、所用移液器和设备要精准。 7、备检样品要合格。
操作要点

严谨的设计，优质的试剂，正确的操作 和良好的仪器是保证ELISA必要条件。
严格遵照规定操作，必能得出准确的结 果。

抗体效价≥1：128，判为阳性； 抗体效价≤1：64，判为阴性； 抗体效价在1：64- 1：128之间，判为可 疑；可以血清需要复检，复检抗体效价 ≥1：128，判为阳性；抗体效价≤1：64， 判为阴性；
五、注意事项


1、实验前必须认真阅读说明书。 2、试剂盒所有浓缩试剂在低温放置下， 可能有无机盐结晶，如果有结晶盐出现， 80℃温育30min可溶解，且不影响实验。 3、所有试剂必须回复室温使用，以免影 响抗原抗体反应


5、同上洗板5次，拍干， 50vl/孔加入底 物溶液（显色液A和B按1：1混合），37 ℃避光温育15min。 6每孔再加50vl终止液终止反应，立即在 450nm波长下读取OD值。
四、结果分析

材料和方法
金标记抗体的制备

离心法: 1) 取一定量的金溶液, 加入单克隆抗体后 , 搅拌 20 min,置于 4℃ 30 min。
2) 按照金溶液体积的 0.04%加入PEG20000 稳定剂。
3) 搅拌 20 min, 置于 4℃, 2 h 以上。 4) 2000 r/min 离心 10 min, 弃沉淀。 5) 8000 r/min离心 30 min, 保留沉淀。 6) 将沉淀用金稀释液悬浮,最终体积为原始体积的 8%。

讨论

在本检测方法的建立过程中 , 采用磁力搅拌加热装置制备的胶体金 , 可有效保证不同批次胶体金制备的实验条件, 包括反应容器、反应时 间、搅拌速度等因素的一致性。 电镜观察胶体金平均粒径为(40.06±0.70)nm, 颗粒外形均一, 尺寸变 异系数小, 可在 NC 膜上自由流动。根据文献选择 40 nm胶体金颗粒 , 因为这一尺寸的颗粒大小适中, 既易于辨识, 又不会影响蛋白质与颗 粒表面的结合, 可使标记材料获得最佳性能。 在特异性实验中, 本研究将各型FMD与其他水泡性疾病特别是SVD一 同检验, 检测结果显示, 非Asia1口蹄疫病料结果均为阴性, 而对FMD 血清型的鉴定符合率为 100%, 由此证实该试剂盒检测口蹄疫病毒时 , 与临床症状相似疾病的病原无交叉, 无假阳性反应, 具有很好的特异 性。
讨论

口蹄疫有 7 个血清型, 因型间抗原性的明显差异, 某个血清型的感染 康复动物不能交叉保护其他血清型病毒的攻击。在特异性实验中, 本 研究将各型 FMD 与其他水泡性疾病特别是 SVD 一同检验, 检测结果 显示, 非 Asia1 口蹄疫病料结果均为阴性, 而对 FMD 血清型的鉴定符 合率为 100%, 由此证实该试剂盒检测口蹄疫病毒时, 与临床症状相似 疾病的病原无交叉, 无假阳性反应, 具有很好的特异性。 敏感性实验结果显示, 试纸条在检测倍比稀释的同型阳性参考样本时, 随着稀释倍数的增加, 检测带的红色条带显色越浅, 说明随着病毒含 量的不断减少, 试纸条的检测能力不断下降。通过与间接血凝试剂盒 以及 PCR 对比发现, 金标试纸条与间接血凝的结果完全一致。与传统 诊断口蹄疫的方法相比, 金标试纸条的样品符合率为 98.75%。而且金 标试纸条检测迅速, 一般在3~5 min 就可以得出检测结果。

口蹄疫疫苗的生产需要按照 GMP 要求对工艺流程实行全程监控， 包括病毒液收获、病毒液过滤、灭活、 浓缩之后活病毒或灭活病毒含量的 监测，对于口蹄疫抗原含量的检测分 为生产过程中的检测及成品疫苗中 抗原量的监督控制。鉴于我国目前的 特殊情况，急需建立一种检测口蹄疫 病毒灭活疫苗中病毒抗原含量的实 验室检测方法 , 配合其它方法以提高 口蹄疫疫苗质量监管力度 , 确保我国 重大动物疫病强制性免疫防控措施 的贯彻执行。

2015 年第 11 期 科学用药
口蹄疫疫苗抗原含量检测方法
赵颖慧 何召庆 / 中国动物保健有限公司
口蹄疫（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV） 是 由 口 蹄 疫 病 毒 引 起的一种急性、热性、高度接触传染 性的动物疫病，对畜牧业有着巨大的 危害。目前大多数国家采取计划免疫 为主的措施预防和控制口蹄疫，口蹄 疫疫苗的质量是保证控制措施实施 的重点，而抗原含量直接决定口蹄疫 疫苗的质量和免疫效力。
或 者 超 速 离 心 获 得 146 S 抗 原， 直 接估测 146 S 的 CF 量。一些生产厂 家通过蔗糖密度梯度离心法获得一 定体积口蹄疫病毒 146 S 病毒粒子 , 使用紫外分光光度计在 259 nm 紫外 光下检测吸收峰，从而测定其含量。 采用这种方法可以快速测定出在紫 外分光光度计图表中病毒峰区域的 146S 病毒粒子含量，并且可以用于 生产过程中病毒和抗原收获量的监 测， 也 可 用 于 成 品 苗 中 口 蹄 疫 病 毒 146 S 抗原含量的测定。测定口蹄疫 病 毒 146 S 抗 原 量 也 可 通 过 氯 化 铯 密度梯度离心法进行定量分析 , 在 ug/ml 水平估测 146 S 抗原量 , 并用 PAGE 凝胶电泳检测口蹄疫病毒抗 原多肽的完整性，并确定其质量。

国家口蹄疫参考实验室诊断检疫技术简介（一）现有诊断检疫技术（试剂盒）本实验室经过多年的研究和实践，建立了病毒分离、补体结合试验（CFT）病毒中和试验（VNT）、血清中和试验等诊断方法，并形成了一套完善的诊断程序，符合国际通用的操作标准。

同时发展了O型口蹄疫正向间接血凝诊断法，口蹄疫和猪水泡病反向间接血凝诊断法，琼脂扩散试验，以及口蹄疫VIA诊断和RT-PCR诊断试剂盒，满足口蹄疫样品的诊断和定型。

近年来，本实验室根据科学技术发展，结合国际组织推荐的口蹄疫诊断检疫技术，研制出了多种试剂盒和检测方法。

1、O型口蹄疫液相阻断ELISA诊断试剂盒液相阻断ELISA是国际兽疫局（OIE）推荐的检测口蹄疫病毒抗体的标准方法。

用分离于我国的口蹄疫O型毒株研制出液相阻断ELISA试剂盒，用于测定牛、猪、羊血清中针对O型口蹄疫病毒结构蛋白的抗体。

本试剂盒主要用途，一是对进出口动物口蹄疫病毒抗体监测；二是监测口蹄疫疫苗免疫抗体，以评价动物群体抗感染能力。

2、口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒（3ABC-I-ELISA）区分口蹄疫感染和免疫动物是国际活畜进出口贸易的必检项目，也是OIE 判定疫情国家和非疫情国家的依据。

本试剂盒适用于活畜进出口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价，检测活畜血清中口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体，以区分感染和免疫动物。

本试剂盒可测出牛感染后长达480天（16个月）的感染抗体，其多项技术指标已超过国外同类产品。

3、口蹄疫多重RT-PCR诊断试剂盒（FMD Multi RT-PCR）本试剂盒适用于病料诊断、反刍活畜和肉品等畜产品染毒检测，特异性扩增病料、O/P液和肉品中的口蹄疫病毒基因片段，确认样品供体是否染毒。

本试剂盒含有三对引物，可扩增多个口蹄疫病毒基因片段，至少适用于口蹄疫O型、A 型和AsiaⅠ型的三个血清型的检测，可查出0.07LD50的病毒量。

4、口蹄疫原位杂交检测法原位杂交是借助核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核酸片段。

常用方法一、蔗糖/氯化铯梯度密度梯度超速离心法原理：146S抗原在特定条件下分布在特定浓度的介质中，于259nm处产生最大紫外吸收峰（用OD259表示），OD259与146S浓度成正比。

操作步骤：将口蹄疫病毒样品置于蔗糖密度梯度中离心，在离心力的作用下，样品中的病毒粒子将沉降到相应的密度梯度层内，经紫外分光光度计259纳米检测时有最高吸收峰，而在其他级份层没有吸收峰。

收集146S吸收峰级份，用紫外分光光度计进行检测，即可对146S含量进行定量。

采用这种简单的方法可以快速测定出在紫外分光光度计图表中病毒峰区域的146S病毒粒子含量，并且可以用于监测生产过程中病毒和抗原的收获量，当然也可以用于成品疫苗中146S抗原含量的测定。

此法的优点是：简单，检测所需的成本低此法的缺点是：受人为影响大，不能分型检测，且操作较为复杂，对仪器设备有较高要求。

二、高效液相色谱法原理：以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入紫外检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

此法的优点是：设备自动化程度高，人为影响少，操作简便，重复性好，成本低且耗时短，可用于大批量连续检测。

此法的缺点是：不能区别不同血清型的抗原。

三、单克隆抗体夹心ELISA定量检测法原理：制备针对口蹄疫病毒146S特异位点的单克隆抗体，然后包被ELISA板，应用酶联免疫吸附原理，根据显色情况判定146S病毒粒子的含量。

此法的优点是：检测速度快，适合大批量检测。

此法的缺点是：制备单克隆抗体成本较高，且过程复杂。

针对不同毒株需要制备不同的单克隆抗体。

非常用方法四、blab/c小鼠免疫抗体测定法原理：给小鼠在注射抗原之后，免疫抗体水平的高低与146S抗体水平相关，使用液相阻断ELISA试剂盒检测抗体滴度。

此法的优点是：测定结果可以判断疫苗中不同血清型抗原的免疫应答，也可以评价疫苗成分，如佐剂、免疫增强剂等的对免疫应答的影响，是一种综合评价口蹄疫疫苗效力的方法此法缺点：本方法属于间接检测方法，且仍待完善，无法精确定量检测146S病毒粒子的含量。

检测口蹄疫血清抗体的方法〔一〕口蹄疫正向间接红细胞凝集试验〔间接血凝试验〕该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物〔细胞毒〕经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。

该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。

1．试验材料 V型96孔110。

医用血凝滴定板、玻璃板〔与血凝板大小相同〕、微量移液器〔10~100微升〕、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管〔内径1.5毫米，长度100毫米〕、铝质试管架〔40孔〕、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。

2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。

①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升参加第1孔，混匀后从中取出50微升参加第2孔，混匀后从中取出50微升参加第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。

此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液1.5毫升，再加阴性血清0.1毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液3.1毫升，第2~5管分别加稀释液0.5毫升，取阳性血清0.1毫升参加第1管混匀后从中取出0.5毫升，参加第2管混匀后从中取出0.5毫升，参加第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升参加血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升参加第11孔；取稀释液50微升参加第12孔。

口蹄疫是由口蹄疫病毒主要感染偶蹄兽引起的一种高度接触性传染病，口蹄疫病毒在易感动物间可迅速传播造成巨大的经济损失。

本文从动物口蹄疫临床症状、病理变化、检疫、防治措施等方面进行讨论。

口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）引起的一种偶蹄类动物高度传染性疫病，FMDV也是一种人畜共患的病毒病原。

一、流行病学人工饲养的猪、牛、羊等偶蹄动物均为易感动物，此外野牛、驯鹿、大象、刺猬等野生动物也为FMDV的易感动物，人也可感染FMDV。

感染FMDV的动物为主要传染源，其呼吸系统、消化系统、生殖系统的多个器官及分泌物和排泄物均带有FMDV，从而污染圈舍、垫料、食槽等，养殖场中的飞鸟、鼠、犬、猫等动物以及饲养管理人员、兽医等工作人员也可称为FMDV的传播媒介。

未经过严格检疫的引进家畜和带有FMDV的精液、胚胎也可成为FMD的传染源。

易感动物可通过皮肤、黏膜、消化道和呼吸道途径感染FMDV发病，其中猪主要通过粪口传播，并且感染FMDV 的猪排FMDV量最大，牛、羊主要通过呼吸道感染FMDV，并且牛对FMDV最易感发病，羊感染FMDV多呈隐性感染。

FMD四季可发，冬、春季节常发，成年动物感染FMDV的病死率低于5%，幼畜约为20%～50%。

二、临床症状口部和蹄部有水疱病变为FMD的特征症状，不同的动物感染FMDV的潜伏期和临床表现可能存在差异。

动物口蹄疫检疫与防控要点文│张福亨（甘肃省甘南藏族自治州玛曲县动物疫病预防控制中心）1.牛。

牛F M D 潜伏期一般为24～48小时，有时可达1周。

病牛体温升高，鼻、口腔黏膜、齿龈等部位出现水疱，流涎增多，水疱破裂后体温正常，水疱部位形成红色糜烂面。

同时，蹄冠和趾间红肿，出现水疱并很快破裂溃烂，FMD病牛表现跛行，病情严重的牛可见蹄匣脱落。

2.羊。

羊感染FMDV的临床症状与牛相似，但也有些不同。

检测口蹄疫血清抗体的方法（一）口蹄疫正向间接红细胞凝集试验（间接血凝试验）该试验是以口蹄疫O、A、C、Asia-1型病毒和猪水泡病病毒的细胞培养物（细胞毒）经PEG浓缩，蔗糖密度梯度超离后纯化的病毒抗原分别致敏戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，而制成的血凝抗原，用于快速检测动物血清中的口蹄疫和猪水泡病特异抗体水平。

该法简易、快速、特异、直观、是当前测抗的实用方法。

1．试验材料V型96孔110。

医用血凝滴定板、玻璃板（与血凝板大小相同）、微量移液器（10~100微升）、塑料咀、微量振荡器、1毫升/5毫升刻度玻璃吸管、玻璃中试管（内径毫米，长度100毫米）、铝质试管架（40孔）、口蹄疫各型和猪水泡正向间接血凝诊断液、口蹄疫O、A、C、Asia-1型阳性血清、SVD阳性血清、阴性血清、稀释液。

2．试验方法根据试验目的可分为用于鉴别诊断；用于监测疫苗接种动物的抗体水平的检测方法。

（1）疫苗接种动物抗体水平监测方法接种何种疫苗就使用何种正向血凝诊断液。

①稀释待检血清在血凝板上1~8孔各加稀释液50微升，取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，混匀后从中取出50微升加入第3孔……直至第8孔混匀后从该孔取出50微升丢弃，保持每孔50微升的剂量。

此时1~8孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16；1：32、1：64、1：128、1：256。

②稀释阴性对照血清取中试管1支加稀释液毫升，再加阴性血清毫升，充分摇匀阴性血清的稀释度即为1：16。

③稀释阳性对照血清取中试管5支，第1管加稀释液毫升，第2~5管分别加稀释液毫升，取阳性血清毫升加入第1管混匀后从中取出毫升，加入第2管混匀后从中取出毫升，加入第3管……直至第5管，此时各管阳性血清的稀释度低次为1：32、1：64、1：128、1：256、1：512。

④滴加对照孔取1：16稀释的阴性血清50微升加入血凝板的第10孔；取1：500稀释的阳性血清50微升加入第11孔；取稀释液50微升加入第12孔。

实验操作指南一、亚洲I型口蹄疫抗体检测液相阻断ELISA（LB-ELISA）试验液相阻断ELISA主要用于检测抗体。

应用于两个方面的目的：⑴检测FMD病毒感染，广泛用于国际贸易中；⑵监测免疫抗体，评价FMD疫苗免疫效力，也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻击能力。

1、反应原理预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了FMD型特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，亦与随后加入的豚鼠搞血清中的抗体结合，再通过兔抗豚鼠IgG酶结合物和底物溶液显色。

按试验孔呈现的颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。

抗体滴定以能阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。

2、主要试剂与耗材⑴主要试剂①捕获抗体：口蹄疫146S兔抗血清②检测抗体：口蹄疫病毒146S豚鼠抗血清③酶结合物：兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物④病毒抗原及病毒对照抗原：用BEI灭活的病毒细胞培养物⑤标准阳性血清和阴性血清⑥底物溶液：邻苯二胺（OPD）/H2O2溶液（具体配制溶化后，再加2片OPD片剂，充分溶解，分装成5 ml或10 ml/瓶，避光-20度保存。

用前避光溶化，临用时每10 ml上述溶液加100ul配备的3%的双氧水）⑦终止液：1.25mol/LH2SO4⑧缓冲液包被缓冲液：0.05MNa2CO3/NaHCO3，PH9.6稀释液：0.05%（V/V）Tween-20加入0.01MPBS，PH7.4（PBST）豚鼠抗血清稀释液：5%脱脂奶粉-PBST洗涤液：0.01MPBST，PH7.4⑵主要仪器材料①ELISA板：96孔平底聚苯乙烯ELISA板。

②抗原抗体反应板：96孔U形夜工聚丙微量板。

③移液器：0.5-20ul，5-40 ul，50-200 ul，200-2000 ul可调节移液器各一把，8道或12道移液器一把，移液槽5-6个，各配套移液枪尖若干。