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中国动物保健2021.06禽流感（avian influenza ，AI ）的潜伏期一般较短，通常为4～5d 。
发病时精神沉郁，食欲、饮欲降低甚至废绝，被毛散乱，体温升高，趴卧不动，偶有流泪。
头部、面部水肿，脚鳞发紫出血，肉垂和鸡冠呈干枯紫色，甚至坏死。
呼吸困难，咳嗽，听诊呈啰音；下痢，粪便呈淡黄或白色。
出现神经症状，共济失调，不能站立或行走。
并且该病为人畜共患病，处理不好不但会危害养禽业的经济发展，还会危害人类身体健康。
1禽流感的流行病学特点1.1传染源主要由感染或携带禽流感病毒的鸡、鸭、鹅等家禽，野外野生鸟类，特别是迁徙性水禽相互传染所致。
1.2传播途径主要通过病禽的分泌物、排泄物、尸体，污染的饮水、饲料和其他物体，直接或间接接触引发感染，主要感染途径为呼吸道和消化道，以及直接接触病毒毒株感染。
人工接种可通过气溶胶经口鼻内、气管内、眼结膜、腹腔、肌肉、静脉和泄殖腔内等途径使易感禽类感染。
1.3易感动物禽流感病毒在世界范围内广泛分布。
许多家禽、野禽、人类、特别是鸭等迁徙水禽，发生病毒感染的概率比其他禽类高，而家养的鸡和火鸡所发生的流感最为严重。
1.4特点多为大流行，世界范围流行。
过去呈三年小流行，五年大流行。
该病主要在寒流较多，气温变化大的秋冬、冬春交替季节流行。
2禽流感的检测技术2.1血清学诊断技术中和试验中和试验的操作步骤复杂，容易造成材料的浪费，临床上不常用，但其为最原始的病毒检测技术，常用来做标准与其他检测方法作比较。
本试验常用鸡胚或组织培养细胞作为样本鉴定禽流感病毒。
中和试验是具有高度的灵敏性和特异性的血清学方法，抗体只和病毒上表面抗原相对应，特别是已吸附的宿主细胞上的病毒颗粒表面的抗原相对应。
所以，在某种特定血清型的中和实验中，抗体只和组内的其他病原发生有限的交叉反应。
琼脂扩散试验琼脂扩散试验检测禽流感时，以具有血凝素活性的鸡胚尿囊液作为样品，采用已知的阳性血清和未知抗原进行病毒抗原型的特异性鉴定。
禽流感实验室检测技术方案禽流感，这个让无数人闻之色变的词汇，已经成为我们生活中无法回避的一部分。
如何快速、准确地检测出禽流感病毒，成为了当务之急。
今天，就让我来为大家详细介绍一下禽流感实验室检测技术方案。
我们需要明确检测的目标。
禽流感病毒有多种亚型，我们要检测的是哪些亚型，需要根据实际情况来确定。
一般来说，H5和H7亚型的禽流感病毒对我国养殖业和公共卫生安全威胁较大，因此，我们将重点检测这两种亚型。
我们要选择合适的检测方法。
目前，实验室检测禽流感病毒的主要方法有病毒分离、血清学检测和分子生物学检测。
病毒分离是传统的检测方法，准确性较高，但操作复杂，耗时较长。
血清学检测通过检测抗体来判断病毒感染情况，速度快，但准确性相对较低。
分子生物学检测，尤其是实时荧光定量PCR技术，具有高灵敏度、高特异性、快速简便等优点，成为近年来禽流感病毒检测的主流方法。
下面，我将详细介绍实时荧光定量PCR技术在禽流感实验室检测中的应用。
一、实验材料1.样本：采集疑似感染禽流感的家禽咽喉拭子、泄殖腔拭子等。
2.试剂：实时荧光定量PCR试剂盒、病毒提取试剂盒等。
3.仪器：实时荧光定量PCR仪、离心机、恒温箱等。
二、实验步骤1.样本处理：将采集的拭子样本放入病毒提取试剂盒中，按照说明书操作，提取病毒RNA。
2.模板制备：将提取的病毒RNA与实时荧光定量PCR试剂盒中的缓冲液、酶混合，进行模板制备。
4.结果分析：观察实时荧光定量PCR仪上的扩增曲线和溶解曲线，判断样本是否为阳性。
三、注意事项1.实验过程中要严格遵循无菌操作原则，防止样本污染。
2.实验室人员要具备一定的分子生物学实验技能，确保实验顺利进行。
3.实验结果要及时记录，并与临床诊断相结合，为疫情防控提供有力支持。
通过实时荧光定量PCR技术，我们可以快速、准确地检测出禽流感病毒，为我国养殖业和公共卫生安全保驾护航。
当然，实验室检测只是禽流感防控工作的一部分，我们还需要加强疫情监测、疫苗接种、生物安全等措施，共同抵御禽流感病毒的侵袭。
禽流感病毒的分离与鉴定技术孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。
如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。
①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。
该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。
禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。
一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。
高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。
①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。
目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。
近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。
文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。
①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。
死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。
由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。
①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。
对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。
内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。
①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。
ELISA 技术在禽流感诊断研究中的应用摘要：禽流感（AI）是目前禽类流行的主要疫病之一，给养禽业和人类健康带来了巨大危害。
由于禽流感病毒血清型众多，致病疫情多样，因此，适时的检测和早期快速诊断是预防和控制禽流感的前提条件。
ELISA 方法以其特异、灵敏、快速、简便，可迅速检测大量样品，使用仪器设备少，利于基层操作等优点成为AI 流行病学普查及早期快速诊断的最实用和有效的方法。
关键词：禽流感ELISA 诊断禽流感（Avian Influenza，AI）是由A 型流感病毒所引起禽类的感染和/或疾病综合征，1878 年首次发生于意大利，目前已在全世界广泛流行，被国际兽疫局确定为A 类传染病。
禽流感病毒感染后引起的临床症状和病理变化，因感染禽的种类、年龄、免疫状况、继发或混合感染状况、病程长短及感染毒株的毒力等不同而异，易与多种禽类疫病相混淆。
因此，诸多高致病性禽流感病毒感染致人死亡的事件使禽流感的防制工作提升到前所未有的公共卫生学高度。
禽流感疫情的多样性和公共卫生学意义，使得禽流感的早期、快速诊断对于疫病的控制尤为重要，传统的鸡胚分离、琼脂扩散试验、血凝抑制试验（HI）等检测禽流感的方法，由于敏感性不高或检验时间较长，不能满足基层检疫和疫病防制的需要，因此禽流感的确诊必需依赖实验室诊断。
ELISA 检测技术以其高敏感性、高特异性、经济、简便的特点，在畜禽疫病诊断和监测中发挥了重要作用。
1 间接ELISA1.1 基于全病毒的间接ELISA黄金海等[1]应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的禽流感病毒（H9N2 亚型AIV）经处理后作为ELISA 检测方法的包被抗原。
并以不同的含量进行包被，建立了定量检测禽流感抗体水平的间接ELISA 方法。
该试验建立的ELISA 方法不仅可检测出血清中禽流感抗体的P/N 值，还可用回归方程算出ELISA 效价，实现定量测定，这为检测鸡群的抗体水平，制定合理的免疫程序提供了科学的依据。
禽流感检测方法研究进展 郑胜男 本硕21 摘要:禽流感是一种可以感染多种禽类和人的烈性传染病,其病毒亚型众多,宿主范围广，容易发生变异和重组，由于各亚型之间无交叉反应性,使得禽流感病毒的检测工作较为困难。目前，该病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，同时,人们也正致力于用一些新兴检测方法来检测禽流感病毒。现就禽流感病毒的检测方法做一综述。 关键词:禽流感病毒;检测方法;AIV；血清;诊断；分子生物；
禽流感是由正黏病毒科、A型流感病毒属中的不同亚型引起的禽类的一种急性高度接触性传染病。目前已知禽流感病毒的血凝素包括16种亚型，[1]神经氨酸酶包括9种亚型。其中H5和H7亚型常为高致病性的禽流感病毒。 1.病原学检测方法 1 .1病毒分离与鉴定 病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，最常用的为细胞接种和鸡胚接种法，以细胞发生病变，鸡胚死亡或培养物尿囊液具有凝集红细胞特性作为判定依据作初步鉴定，也可用针对NP的单抗,用免疫荧光染色作病毒的初步鉴定。[2]确诊还需其它辅助检测手段。其检测结果准确可靠，灵敏，极少量病毒也可检出。但其操作程序繁杂，费用高，实验室要求高，耗时费力，周期长，检测时间需1～3 周，大面积应用推广受到较大限制。 1 .2电镜检测技术 用电镜技术或免疫电镜技术诊断禽流感病毒，可以在电子显微镜下清楚观察到粒子形态，确定病毒的有无。[3]、[4]电镜技术快
速、准确，但检验结果与样品制备技术、取病材料的部位和时间有关，且本方法不能用于亚型及致病性的测定。 2.免疫学检测 2 .1血凝(HA )和血凝抑制(HI)试验 HA 和HI 简单、快速、特异性好，但是操作繁琐费时，不能用已知HA亚型的抗血清检出禽流感新的HA亚型。HI试验是WHO进行全
球流感监测所采用的普及方法。[5]一般先将可疑病料接种适龄鸡胚或细胞进行病毒分离，然后用HA试验检测出培养物是否具血凝素活性， 再用已知阳性血清进行HI试验来验证。[6]
2 .2琼脂扩散试验(AGP) AGP试验是用来检测A型流感病毒群特异性血清抗体，适用于鉴定所有A型流感病毒。AGP试验操作简单，既可以定性又可以定量。但敏感性差，易有有假阳性。现已在AIV快速定型双扩散法[7]基础上建立了AGP诊断试剂盒。AGP试验可以用敏感性、准确性良好的尿素- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法作为补充或辅助诊断手段。[8] 2 . 3乳胶凝集试验(LAT) LAT 是以聚苯乙烯乳胶颗粒作为载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到血清中相应的抗体或处理过的病料中相应的抗原成份时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。[9]乳胶凝集试验操作简单、快速，不需要贵重的仪器设备和操作技能。由于LAT 所识别的IgM 抗体是机体最先产生的抗体，LAT 更适合进行早期诊断。 2 .4神经氨酸酶抑制试验(NIT) 神经氨酸酶抑制试验是依据A型流感病毒的表面抗原神经氨酸酶的特性来鉴定流感病毒。van Deuson R A等[10]对常量NIT试验方法进行改进建立了平板微量NIT方法,不仅降低了抗原用量,而且
可对多种分离物同时进行抗原分类。,此法一直被世界卫生组织推荐用于神经氨酸酶亚型的分类。[11]
2 . 5病毒中和试验（NT） NT试验是最经典的血清学方法之一,只有在抗体与病毒粒子上的表面抗原相对应,特别是与吸附到宿主细胞上的病毒抗原相对应时,才能在实验中取得满意效果。[12]因此,NT试验是最敏感而特异的血清学方法,检出率也相当高，但操作繁琐且耗时。 2·6免疫荧光技术(IFA) 免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体上，与其相应的抗原结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应,包括直接荧光抗体法和间接荧光抗体法,后者较常用。IFA特异性强、敏感性好,[13]可用于鉴定和定位禽流感病毒感染的细胞中特异性的抗原,主要是核蛋白和基质蛋白抗原。但是对抗原制备要求高,结果判定的客观性不足,出现假阳性的概率较高,因此,只是一种筛选方法。 2 . 7酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA是用酶标记抗原或抗体,通过显色反应来检测相应抗体或抗原的一种方法,可进行定性和定量测定。ELISA方法的敏感性和特异性与包被抗原或抗体的纯度直接相关,高于传统方法的AGP试验和HAI试验,而且更快速，既可检抗原也可检抗体。目前已建立了禽流感病毒重核蛋白ELISA法、禽流感抗体斑点-ELISA(Dot-ELISA)检测法等。[14]
2·8侧流免疫测定(LFA) LFA技术的检测原理是乳胶珠或胶体金标识的抗原-抗体复合物侧向迁移,直至遇到在一种固定表面(膜支持物)上的抗体,结合滞留后可肉眼观察显色反应。LFA具有分析迅速的优点,可用于现场检测。[15]
2·9胶体金免疫层析法(GICA) GICA应用免疫层析的原理,将抗原或单克隆抗体固定在层析介质上,待检标本的抗原或抗体通过毛细脉动,结合后滞留在该位区,根据胶体金免疫显色反应做出判断。GICA是一种快速简便的方法,可在15~30 min内获得诊断结果,具有不需实验设备、可用肉眼判定、试剂用量少、稳定性和重复性好,特异性强等优点,适合于现场快速初筛定性。缺点是对禽流感检测的敏感性较低，容易漏检或假阳性,不易定量,不方便大批量的集约操作。[16] 2.10压电生物传感器检测仪 该技术采用戊二醛交联法,将禽流感H5、H9、禽流感全抗原(HI)等抗原固定于银电极表面,制成多通道的压电免疫传感器,判定标准为检测阳性样品的响应值与阴性样品的噪声值之比>3，可用于AIV的定性定量检测。生物传感器灵敏度高、响应快,不需要标记,可同步进行禽流感病毒的定性定量和分型诊断检测,具有高灵敏度、小体积、快速、低成本、便于携带等优点。[17]但需要压电蛋白芯片分析仪等仪器设备,限制了其实际应用。 3.分子生物学检测方法 3·1逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) RT-PCR是提取禽流感病毒的总RNA,用逆转录酶反转录成cNDA后进行PCR扩增。整个检测过程约需8h,可检测出禽流感病毒核酸分子,并可用针对性的引物来进行分型鉴定。RT-PCR禽流感病毒检测法仅用一对引物即可扩增出H1~H15的HA基因,产物由双脱氧核酸链止法测序分析。[18]PCR-ELISA方法能从更微量的水平检测禽流感病毒,既适合于快速的定性筛选又可进行定量分析。[19]多重RT-PCR(mRT-PCR)能一步同时检测多种亚型的禽流感病毒,更为快速和经济。采用巢式或半巢式RT-PCR可提高扩增的灵敏度和特异性,并使检测的亚型范围进一步扩展。[20]
3·2实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR) 实时荧光定量是在反应体系中利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线或公式法对禽流感病毒的RNA模板进行定性和定量分析的方法。荧光化学方法应用较多的为TaqMan水解探针、FRET杂交双探针和SYBR green荧光染料法等。RRT-PCR使检测时间缩短为4 h,敏感性接近鸡胚病毒分离;探针的应用使假阳性达到最小化,并且采用全封闭反应,杜绝了PCR产物的气溶胶污染。[21]RRT-PCR技术实现了PCR从定性到量的飞跃。 3·3环介导的等温扩增(LAMP) LAMP是一种新的基因高效扩增技术,反应体系简单,由模板DNA、4对特异性引物、BstDNA聚合酶、dNTP和反应缓冲液构成。在65℃左右的恒温条件下,BstDNA聚合酶催化引物反复进行高效的链置换反应和环介导扩增,整个反应约需30~60 min。[22]LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法,不需要特殊的试剂和仪器设备,因此,可以建立起总成本低廉的检测体系,适用于现场监测和大量样品高通量筛检,在禽流感检测和防治领域具有广阔的应用前景。 3·4依赖核酸序列的扩增(NASBA) NASBA是一项以RNA为模板,以转录原理为基础的快速等温扩增技术。该技术需使用逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RNA酶H(RNaseH),以及2条特别设计的寡核苷酸引物,NASBA技术从禽流感病毒核酸分离、扩增以检测整个过程只需4 h,灵敏度与鸡胚培养相当,扩增效率高于传统RT-PCR,在适宜条件下,扩增倍数可达1012。NASBA技术操作简便,一般为42℃等温扩增,不需要PCR仪等设计,并且在即使有基因组DNA污染的情况下也可以特异性扩增出目的RNA。NASBA是全封闭反应,产物为RNA,不易对实验仪器造成交叉污染,[23]而且还是一种高通量的方法,非常适合于大规模样品的筛查。在NASBA技术上进一步发展出的实时NASBA技术,[24]使检测的敏感性和特异性更为提高 3·5基因芯片(gene chips) 基因芯片是指将大量的核酸分子以大规模阵列形式固化在载玻片等芯片载体上,通过与Cy3、Cy5荧光素标记的样品进行核酸杂交,检测杂交信号的有无和强弱进而判断样品中被检分子的种类和数量。根据探针的特点不同可以将基因芯片技术分为3类:
cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因芯片。目前,最新的核酸探针检测技术是以微电子为平台的芯片技术，该项技术通量高，,检测禽流感病毒的时间7 h左右，[25]但是操作较繁琐,检测成本及硬件要求均较高,离实际应用还有一段距离。 3.6 核酸探针与原位杂交技术 核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片断，能与其互补的核酸序列杂交，形成双链。原位杂交是经适当处理后使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA 杂交。地高辛标记cDNA探针具有较好的特异性和敏感性，为从分子水平探讨AI 的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。制备NP保守性的探针感染病毒MDCK细胞进行原位杂交检测禽流感病毒RNA 的方法，[26]不但能很好地呈现病毒和细胞的位置关系，而且具
