sephadex知识剖析

sephadexg100柱层析原理
Sephadex G-100柱层析是一种凝胶过滤柱层析方法，用于分离和纯化生物分子，例如蛋白质、核酸和多肽等。

基于凝胶过滤原理，Sephadex G-100是由纤维素经化学修饰得到的高分子化合物，具有高度多孔的三维网状结构。

其孔径大小可根据需要进行调整，常用的G-100型号指的是其平均孔
径大小为100 Å。

在Sephadex G-100柱层析中，样品溶液首先被添加至柱层析
填料中，然后以缓冲液进行洗脱。

由于Sephadex G-100的高
度多孔结构，较大分子无法进入凝胶内部而被排除在外，较小分子则能够进入凝胶内部并逐渐渗透到凝胶颗粒深处。

因此，分离的结果是根据生物分子的大小而实现的，较大分子在柱顶部洗脱，较小分子则需要更长的时间才能出现在柱底部。

通过Sephadex G-100柱层析，可以实现蛋白质的初步纯化和
分子量测定，以及核酸和多肽的分离纯化。

此外，Sephadex
G-100柱层析方法简单、操作方便，并且具有较高的分离效率，因此在生物学和生物化学实验中得到广泛应用。

Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质一.实验原理凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。

凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。

当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。

比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。

这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

二.试剂器材Sephadex G-75粉末洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，pH8.0)：取Tris 1.2114g和NaCl 5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至8.0，再用蒸馏水定容至1000mL；其他器材： 18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等三.操作步骤凝胶的制备：称取Sephadex G-75粉末20g，加双蒸水400ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3hr，冷却至室温抽真空30min以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的双蒸水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；平衡：凝胶床用洗脱液平衡过夜，约2个柱体积；加样：称取样品溶解于5mL的洗脱液中。

（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。

例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。

交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。

因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。

⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。

（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。

琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。

一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。

琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。

（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。

交联剂越多，孔隙越小。

聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。

（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。

三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。

层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。

凝胶使用方法及注意事项1原理Sephadex LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

2.前处理及装柱Sephadex LH-20在使用前必须进行溶胀，溶胀过程中必须避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒。

（1）室温下，将凝胶溶胀于层析液（一般为甲醇）中至少三小时（2）使溶胀胶体积沉淀后占总体积的75%，上层溶剂占25%凝胶悬浮液黏度要适宜A．太稠会在搅拌时产生气泡；太稀会导致装柱时沉降时间长，加凝胶悬浮液的次数增加；B．将凝胶悬浮液静止后所得上清液弃去，保留高于凝胶液面约1 cm的液体即可；C 装柱混悬液的浓度以流动性好，搅拌阻力小为宜。

（3）装柱的要点A 装柱前，先在色谱柱中加入约1/4柱高的液体（溶胀时所用的试剂）；B 装柱时，将下端活塞打开，流速尽量大，但要保证小于凝胶沉降速度，否则会干柱；C将凝胶悬浮液搅拌均匀，以漏斗倒入柱子中即可；3.流动相1.分子筛作用，常用的是甲醇、甲醇+氯仿混合溶剂。

甲醇：氯仿一般为1：1左右，切不可用氯仿做为流动相！氯仿比重大，用单纯的氯仿做流动相，填料将浮起来，严重影响分离效果！！2.反相分配作用，常用的是甲醇/水，比例可以根据实际情况进行调整，也可以是梯度洗脱（先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱）4.样品的处理及洗脱过程（1）.最重要的一点：用尽可能少的溶剂溶解样品，样品可以很浓。

如果溶解体积很大，一定要先进行浓缩，否则基本没有多大的分离效果。

上样体积一般为柱体积的1%~5%。

（2）.很重要的一点：尽可能用起始洗脱溶剂溶解样品（很多情况下样品并不能在起始溶剂中很好地溶解）。

1. 概述Sephadex G-10 是一种常用的葡聚糖凝胶，具有广泛的应用范围。

在生物化学、分子生物学等领域中，它被广泛用于分离和纯化生物大分子，例如蛋白质、核酸等。

而Sepahdex G-10的孔径大小则是影响其分离和纯化效果的重要因素之一。

2. Sephadex G-10的基本介绍2.1 Sephadex G-10是一种由交联葡聚糖制成的凝胶，属于凝胶过滤层析介质的一种。

它以其较大的孔径而闻名，这使得它在许多生物大分子的分离过程中具有重要的应用价值。

2.2 Sephadex G-10的结构具有高度规则的孔隙结构，能够可靠地分离分子，并且不易受到外界因素的影响。

2.3 在分子生物学和生物化学的实验中，Sephadex G-10经常被作为一种理想的分离介质，用于分离蛋白质、核酸等大分子物质。

3. Sephadex G-10的孔径大小3.1 Sephadex G-10的孔径大小通常为10微米左右。

这种中等大小的孔径使得它能够有效地分离分子，但也相对于有一定的分辨能力，不会因为孔径过大而导致分离效果不理想。

3.2 对于一些较大的生物大分子，例如大分子蛋白质、核酸等，Sephadex G-10的孔径大小能够保证其能够顺利地通过凝胶中的孔隙，实现有效的分离和纯化。

4. Sephadex G-10的孔径大小对分离效果的影响4.1 由于Sephadex G-10的孔径大小适中，它能够较好地区分不同大小的分子。

对于较小的分子而言，它们能够更容易地穿过Sephadex G-10的孔隙，实现快速的分离。

4.2 对于较大的生物大分子，Sephadex G-10的孔径大小也能够保证其能够通过凝胶的孔隙，实现高效的分离。

这就体现了SephadexG-10的孔径大小对于分离效果的积极影响。

5. 结语Sephadex G-10作为一种常用的葡聚糖凝胶，在分离和纯化生物大分子的过程中具有重要的应用价值。

其孔径大小的适宜性，使得它能够有效地区分不同大小的分子，实现高效的分离和纯化。

几种分子筛凝胶及应用做纯化的人可能经常接触到sephadex，BIO-Gel，sephacryl s-,sepha rose BIo-Gel等几种填料，有时会混淆在一起，看到一个贴子较好的介绍了这些填料的区别，希望对大家有用。

sephadex(葡聚糖凝胶）：是由葡聚糖苷和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互铰链而成，不同型号的葡聚糖凝胶用英文字母G表示，如G-25，G-75等，G后面的数字为凝胶吸水量再乘以10。

sephacryl：为葡聚糖偶联丙烯基，再和甲叉双丙烯酰胺聚合而成的介质。

它有较高的硬度，能承受比普通凝胶更大的静水压力，由于属于部分大网孔型凝胶，可用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖甚至是病毒颗粒。

sepharose琼脂糖：瑞典称sepharos e；美国称Bio-gel A；英国称Segavac；丹麦称Gelarose。

Sepharose主要有三种型号：2B，4B，6B，阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。

Bio-GA有6个型号：0.5M,1.5M,5M,15M,50M,150M。

阿拉伯数字乘以100 0000表示排阻限度。

Sagavac分为：2F,4F,6F,8F,10F2℃4C6℃8C10℃阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量，F表示粉末状，C表示颗粒状。

Gelarose有5种类型：2%，4%，6%，8%，10%。

百分数表示干胶量。

琼脂糖凝胶属于大孔胶，由于其工作范围的下限几乎相当于葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶的上限，所以多用于分离400000以上的物质，比如核酸和病毒。

聚丙烯酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺合成线性多聚物，商品名为Bio-Gel P，有十种类型：从Bio-Gel P-2到P-300，p后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度。

这种胶在极端ph下可被水解，水解后形成的羧基，具有离子交换的性质。

另外，sephadex G是葡聚糖凝胶交联的，用于除盐和纯化，BIO-Gel P-是聚丙烯酰胺凝胶，它们的刚性都不是很好，尤其是得水值越大的，越是如此。

页眉内容1. Sephadex LH-20简介羟丙基葡聚糖凝胶LH-20是一种Sephadex G-25的羟丙基衍生物，字母LH的含义是这种凝胶骨架在亲脂溶剂中或在水溶剂中都能溶胀。

在G-25分子中引入羟丙基以代替分子中羟基上的氢，葡聚糖凝胶分子的葡萄糖部分将与羟丙基形成醚键连接：R—OH――→R—O—CH2CH2CH2OH与Sephadex G相比，Sephadex LH-20分子中-OH总数虽无改变，但碳原子所占比例却相对增加了，从而使葡聚糖的亲脂性增大。

这种凝胶既有亲水性，又有亲脂性，不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用，如丁醇、氯仿、四氢呋喃、二氧六环等，应用范围增大，对黄酮、蒽醌、香豆素等成分也能分离。

SephadexLH-20除保留有Sephadex G-25原有的分子筛特性，可按分子量大小分离物质外，在有极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的效果，适用于不同类型有机物的分离，在天然药物分离中得到了越来越广泛的应用。

使用注意事项：羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20虽然是一种两性凝胶，但由于在不同溶剂中的溶胀因子各不相同（见表1），因此在柱中直接更换溶剂是不允许的，床体积在2.5mL ／g干胶以下的不能用于GPC分析。

这种凝胶在有机溶剂中分离较小分子量的脂溶性化合物是十分有效的。

但在使用时不允许有氧化剂存在。

再生与保存：Sephadex LH-20价格比较昂贵。

用过的Sephadex LH-20可以反复再生使用，而且柱子的洗脱过程往往就是柱子的再生过程。

短期不用时可以水洗→含水醇洗(醇的浓度逐步递增)→醇洗，最后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。

如长期不用时，可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，60～80℃干燥后保存。

Sephadex LH-20不仅具有亲水性能，可以吸水膨胀，而且也有一定的亲脂性，可以吸收有机溶剂而膨胀。

sephadexg100柱层析原理以sephadexg100柱层析原理为标题，本文将介绍sephadexg100柱层析的原理和应用。

一、sephadexg100柱层析原理sephadexg100柱层析是一种基于分子大小分离的柱层析技术。

其原理是利用聚合物凝胶sephadexg100作为填料，通过其孔径大小的选择性分离不同大小的分子。

sephadexg100是一种由葡萄糖单体聚合而成的凝胶，具有一定的孔径大小。

通过调节sephadexg100的孔径大小，可以实现对分子的选择性分离。

较大的分子无法进入sephadexg100的孔径中，因此会快速通过；而较小的分子可以进入孔径中，因此会较慢地通过。

二、sephadexg100柱层析的操作步骤sephadexg100柱层析的操作步骤如下：1. 准备sephadexg100柱：将sephadexg100填充到柱子中，并保持柱子垂直。

2. 预洗柱子：用适当的缓冲溶液预洗柱子，以去除填料中的杂质。

3. 样品加载：将待分离的混合物溶解在适当的缓冲溶液中，然后将溶液加载到柱子上。

4. 洗脱：使用缓冲溶液逐步洗脱柱子上的目标分子。

较大的分子会快速通过，较小的分子会较慢地通过。

5. 收集洗脱液：根据需要，收集洗脱液中的目标分子。

三、sephadexg100柱层析的应用sephadexg100柱层析广泛应用于生物化学、分子生物学和制药等领域。

它可以用于分离和纯化蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。

1. 蛋白质纯化：sephadexg100柱层析可以根据蛋白质的分子大小，实现对不同大小的蛋白质的分离和纯化。

由于蛋白质的分子大小差异较大，sephadexg100柱层析在蛋白质纯化中有广泛应用。

2. 核酸纯化：sephadexg100柱层析也可以用于核酸的纯化。

核酸的大小差异较大，因此可以通过sephadexg100柱层析将不同大小的核酸分离。

3. 多糖分离：sephadexg100柱层析还可以用于多糖的分离和纯化。

sepharose 亲和色谱法Sephadex亲和色谱法亲和色谱法是现代生物分离工艺中常用的一种方法，广泛应用于制药、生命科学等领域。

Sephadex亲和色谱法是其中一种常见的亲和色谱法技术，以Sephadex吸附材料为基础，通过静电作用或化学键等特定相互作用，使目标生物分子选择性地与吸附材料结合，实现其分离纯化。

本文将从Sephadex亲和色谱法的基本原理、操作步骤、应用前景等方面进行介绍。

一、Sephadex亲和色谱法的基本原理Sephadex亲和色谱法的基本原理是基于分子间的亲和作用，即生物分子与亲和基质之间的特异性结合。

在Sephadex亲和色谱法中，一般会选择合适的亲和基质作为吸附材料，如金属离子、抗体、蛋白质等。

这些亲和基质能与目标生物分子通过静电作用、亲水作用、疏水作用等相互作用形成稳定的复合物，从而实现目标生物分子的分离纯化。

二、Sephadex亲和色谱法的操作步骤1. 样品制备：将待分离的混合样品经过必要的前处理，如细胞破碎、蛋白质沉淀等，得到纯化后的目标生物分子。

2. 亲和色谱柱填充：选取适合的Sephadex材料填充色谱柱，可以根据目标生物分子的特性选择合适的亲和基质，并将其与Sephadex材料结合。

3. 样品上样：将纯化后的目标生物分子与填充好的色谱柱接触，通过静电作用或化学键等相互作用，使目标生物分子选择性地与亲和基质结合。

4. 洗脱分离：通过适当的洗脱缓冲液，改变色谱柱内部的条件，破坏目标生物分子与亲和基质间的结合力，实现目标生物分子的洗脱。

5. 分析纯化：收集洗脱出的目标生物分子样品，并使用合适的分析方法进行检测和定量，评估纯化效果。

三、Sephadex亲和色谱法的应用前景Sephadex亲和色谱法由于其简单易行、操作灵活等特点，在生物制药、疾病诊断、蛋白质研究等领域具有广泛的应用前景。

首先，Sephadex亲和色谱法可以用于制备药物中的目标分子。

比如，在药物开发过程中，通过亲和色谱法可以高效纯化药物的活性成分，减少其他有害成分的干扰，提高药物的纯度和活性，从而增强药物的效果和安全性。

SephadexG-1凝胶层析Tina 发表于 2006-2-21 12:27:00材料与仪器Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，浓缩液层析柱二、方法与步骤1）Sephadex G-100 凝胶预处理a)100ml烧杯，称取5克sephadex G-100,加入50ml去离子水，浸泡溶胀24小时。

b)倾去sephadex G-100溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0 mol/LNaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡1小时处理后倾去。

用去离子水洗涤。

洗涤过程中，用倾去法除去细颗粒。

其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。

浮选3-5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至PH中性。

c)将Sephadex G-100凝胶水溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡，将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有1/2去离子水。

2) 装柱a)层析柱(1.0 50cm)用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。

将层析柱垂直装好。

校直过程用下端绑有钥匙的绳子挂于铁架的不同位置，从多角度校正使柱垂直。

打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。

最终柱内留存有2 cm的水。

从出口处接上一根直径2 mm细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。

b)搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降，待柱底面上积起约1-2 cm的凝胶床后，打开柱出口水流。

随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅棒均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，影响层析效果）。

c)凝胶沉积到柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。