紫外分光光度计测蛋白质含量

紫外分光光度法测定蛋白质含量化学2班李永亮41007061【实验目的】（1）学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；（3）掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

【实验原理】本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。

该测定法具有简单、灵敏、快速高、选择性，且稳定性好，干扰易消除，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一对于测定那些与标准蛋白质中赖氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；其二若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

【实验仪器与试剂】仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管，胶头滴管试剂：标准蛋白质溶液（3.00mg/mL）,0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液【实验步骤】一、准备工作1、启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。

2、在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。

3、将空白放入测量池中，点击开始扫描空白，点击基线校零。

4、标准曲线的绘制二、测量工作1、吸收曲线的绘制用吸量管吸取2mL3.00mg/mL 标准蛋白质溶液于10mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。

用1cm 石英比色皿，以0.9% NaCl 溶液为参比，在190 nm ～400nm 区间，每隔2nm 测量一次吸光度，记录数据。

2、标准曲线的制作用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 3.00 mg/mL 标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。

6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so42co2+3so2+4h2o+nh3（1）2nh3+h2so4（nh4）2so4（2）（nh4）2so4+2naoh2h2o+na2so4+2nh3（3）反应（1）、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以625即得。

二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经1800c左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定范围为1-10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

实验三 紫外分光光度法测定蛋白质一、原理由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm 。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，这是由于：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。

故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

核酸强烈吸收波长为280nm 的紫外光，它对260nm 紫外光的吸收更强。

但是蛋白质恰恰相反，在280nm 的紫外吸收值大于260nm 的紫外吸收值。

利用这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。

但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。

在测定工作中，可利用在280nm 及260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280nm —0.74A260nm ，式中：A280nm 是蛋白质溶液在280nm 下测得的光吸收值；A260nm 是蛋白质溶液在260nm 下测得的光吸收值。

Warburg 和Christian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对有核酸存在时所造成的误差作了评价，并作出了一个校正表(如下)。

紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子F0.6565.500.8461.1160.001.750.6320.6070.5850.5650.5450.5080.4780.4220.3770.3220.2786.006.507.007.508.009.0010.0012.0014.0017.0020.000.8220.8040.7840.7670.7530.7300.7050.6710.6440.6150.5951.0811.0541.0230.9940.9700.9440.8990.8520.8140.7760.7430.6820.250.500.781.001.251.502.002.503.003.504.005.001.631.521.401.361.301.251.161.091.030.9790.9390.874校正因子核酸%A 280nm /A 260nm校正因子核酸%A 280nm /A 260nm注：一般纯蛋白质的A280nm/A260nm 值为约1.8，而纯核酸的A280nm/A260nm 值为约0.5。

教材1 紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法, 它是研究分子吸收190nm ～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。

进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。

即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。

定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc ，当入射光波长λ及光程b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A 与该物质的浓度c 成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。

因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。

由于最大吸收波长λmax 处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax 的吸光度，以获得最大灵敏度。

光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b 的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I 0，通过待测溶液的透光强度为I ，根据上式，由仪器直接给出I 0与I 之比的对数值即吸光度。

紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光, 该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A 。

可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池; 紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。

紫外分光光度法测定蛋白质含量1 仪器与试剂TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管标准蛋白质溶液：5.00 mg.mL-1溶液0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液2 实验方法与原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。

紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。

蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。

在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。

该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。

3 实验步骤3.1 准备工作3.3.1启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。

3.3.2 在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。

3.3.3 将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。

3.3.4 标准曲线的XXX。

3.2 测量工作3.2.1吸收曲线的绘制用吸量管吸取2mL5.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。

用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液为参比，在190 nm～400nm区间，q全波段扫描。

3.2.2标准曲线的XXX用吸量管分别吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5mL 5.00 mg.mL-1标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。

用1 cm 石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光记录所得读数。

紫外吸收法测定蛋白质含量
（一）目的
学会用紫外吸收法测定蛋白质含量的方法。

（二）仪器
751型分光光度计
（三）原理
大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。

但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，warburg——等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。

该方法是以酵母烯酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来误差。

（四）方法步骤
1．取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于751型分光光度计波长280nm和
260nm，分别读取A
280和A
260
，用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白
对照。

2．根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。

蛋白质含量（mg/ml）=1.55A
280—0.76A
260
（五）实验报告
计算所测材料蛋白质的含量。

（六）思考题
1、这里介绍了几种测定蛋白质含量的方法，它们所根据的原理是什么？
2、试比较测定蛋白质含量的几种方法的优缺点。

紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400 nm 可见光：400-780 nm(可被人们的眼睛所感觉)特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长; 定量分析-朗伯-比尔定律(标准曲线法和标准加入法) a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.b.定量分析原理：根据朗伯-比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。

c.仪器组成部件:各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：(1)蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。

该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

(2)此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。

据初步统计，浓度为1.0 mg/mL 的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。

国标紫外分光光度法测定蛋白质含量蛋白质是构成生物体内各种细胞、器官和组织的主要物质之一，其含量的测定对于科学研究和工业生产具有重要意义。

目前国际上常用的测定蛋白质含量的方法有比色法、低力荧光素法和生物素-四硫化物法等，而国家标准推荐使用紫外分光光度法测定蛋白质含量，因其准确性和可靠性较高，具有广泛适用性。

一、实验原理国标紫外分光光度法利用蛋白质分子内含有色氨酸（W）、酪氨酸（T）和苯丙氨酸（F）等氨基酸团的紫外吸收特性，即在近220nm处有吸收峰。

通过分析样品在220nm处的吸光度值，就可以计算出其蛋白质含量。

二、实验步骤1. 样品的制备将所需测定的物质按照预定比例溶解在适量的缓冲溶液中，混合均匀，离心沉淀物质后，称取上清液并记录其质量，得到样品洗脱液。

2. 样品的测定(1)制备含有对照蛋白质的样品洗脱液。

将已知浓度的蛋白质按需求浓度稀释后，制成一系列的对照样品，称取适量的对照样品，经过与样品液的处理过程相同的操作后，得到对照样品洗脱液。

(2)利用紫外分光光度计测量样品洗脱液和对照样品洗脱液在220nm处的吸光度，记录数据。

(3)计算样品洗脱液中蛋白质的含量。

根据统计学方法，将同一浓度蛋白质的对照样品的吸光度取平均值，并绘制标准曲线。

根据样品洗脱液的吸光度值和标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。

三、实验注意事项1. 操作时需严格按照实验指导书的规定操作。

2. 紫外分光光度计在对样品洗脱液进行吸光度测定时，应使用二元芳香胺半波长试管作为样品池。

3. 为防止各种最终洗涤液误差的影响，应利用含有NaHCO3 or Na2CO3的去离子水作为纯化洗涤液。

四、实验结果的分析利用国标紫外分光光度法测定出的蛋白质含量，可点评该样品是否符合质量要求。

若蛋白质含量低于标准要求，则说明样品质量不好，需再次提取纯化；若蛋白质含量超过标准，则说明提取效率较好，但仍需注意实验中的误差，以获得更加准确的结果。

总之，国标紫外分光光度法测定蛋白质含量是一种可靠、简便、经济的方法，可广泛应用于生物科学、医药研究、食品工业等领域，对于推动相关研究和产业发展起到了积极的促进作用。

紫外分光光度计——蛋白质含量测定紫外可见分光光度法是在190～760nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。

当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。

因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。

从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。

物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。

因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。

用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。

紫外分光光度法测量光谱法（spectrometry）是基于物质与电磁辐射作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。

光谱法可分为发射光谱法、吸收光谱法、散射光谱法；或分为原子光谱法和分子光谱法；或分为能级谱，电子、振动、转动光谱，电子自旋及核自旋谱等。

分光光度法是光谱法的重要组成部分，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

常用的技术包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法和原子吸收分光光度法等。

物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。

在一定条件下，物质的吸收系数是恒定的，且与入射光的强度、吸收池厚度及样品浓度无关。

当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。

在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称之为比色分析。

蛋白质与生命的起源、存在和进化都密切相关,蛋白质测定涉及到生产和利研的众多领域。

紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。

2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3.掌握TU-1901紫外可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400 nm可见光：400-780 nm(可被人们的眼睛所感觉)特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析最大吸收波长; 定量分析：朗伯-比尔定律(标准曲线法和标准加入法)a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状b.定量分析原理：根据朗伯-比耳定律： A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。

c. 仪器组成部件: 各种类型的紫外可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：(1)蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。

在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。

该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

(2)此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。

据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。

紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量一、本文概述本文旨在探讨紫外分光光度法在快速测定液体奶和奶粉中蛋白质含量方面的应用。

紫外分光光度法是一种基于物质对紫外光的吸收特性进行定量分析的方法，具有操作简便、快速准确、适用范围广等优点，因此在食品营养成分分析中得到了广泛应用。

本文将详细介绍紫外分光光度法的基本原理、实验步骤及注意事项，并通过实例分析验证该方法在液体奶和奶粉中蛋白质含量测定中的准确性和可靠性。

本文还将讨论该方法相较于传统蛋白质测定方法的优势，以及在实际应用中的潜力和局限性。

通过本文的研究，旨在为液体奶和奶粉生产的质量控制、食品安全监管以及营养学研究提供有力支持。

二、紫外分光光度法原理紫外分光光度法是一种基于物质在紫外光区（通常指波长范围在200-400纳米）对光的吸收性质进行分析的方法。

在液体奶和奶粉中蛋白质含量的测定中，该方法主要利用蛋白质分子中的芳香族氨基酸（如色氨酸和酪氨酸）以及某些特定的肽键在紫外光区具有吸收峰的特性。

当紫外光通过这些含有蛋白质的样品时，部分光能被蛋白质分子吸收，导致光的强度减弱。

根据朗伯-比尔定律，光强度的减少与样品中蛋白质的浓度成正比。

因此，通过测量紫外光通过样品前后的强度变化，可以计算出样品中蛋白质的浓度。

在紫外分光光度法中，常用的波长通常为280纳米，因为这是大多数蛋白质在紫外光区的主要吸收峰。

为了消除其他可能干扰测定的物质（如核酸）的影响，通常还会使用多个波长（如260纳米）进行校正。

通过比较不同波长下的吸光度值，可以更加准确地计算出蛋白质含量。

紫外分光光度法具有快速、简便、灵敏度高和成本较低等优点，因此在食品工业中得到了广泛应用。

然而，需要注意的是，该方法只能提供蛋白质总量的信息，无法区分不同种类的蛋白质。

对于含有较多非蛋白质成分或具有特殊光学性质的样品，可能需要采用其他方法进行蛋白质含量的测定。

三、实验材料与方法本实验采用紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中的蛋白质含量。

紫外分光法测定蛋白质含量实验流程英文回答：Ultraviolet Spectrophotometry for Protein Quantification.Principle:Ultraviolet spectrophotometry is a widely used technique for protein quantification. It is based on the principle that proteins absorb ultraviolet (UV) light at a wavelength of 280 nm, primarily due to the presence of aromatic amino acids (tyrosine and tryptophan) in their structure. By measuring the absorbance of a proteinsolution at 280 nm, the concentration of the protein can be determined.Materials:UV-Vis spectrophotometer.Quartz cuvettes.Protein sample.UV-transparent buffer (e.g., phosphate-buffered saline)。

Procedure:1. Prepare the sample: Dilute the protein sample in the UV-transparent buffer to an appropriate concentration range (typically 0.1-1 mg/mL).2. Zero the spectrophotometer: Fill a quartz cuvette with the UV-transparent buffer and place it in the spectrophotometer. Set the wavelength to 280 nm and adjust the instrument to zero absorbance.3. Measure the absorbance of the sample: Replace the buffer cuvette with a cuvette containing the protein sample and measure the absorbance at 280 nm.4. Calculate the protein concentration: The protein concentration can be calculated using the Beer-Lambert Law:Concentration (mg/mL) = (Absorbance Dilution Factor) / (Extinction Coefficient)。

紫外吸收法测定蛋白质含量（一）原理蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。

在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。

若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。

此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。

但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。

（二）试剂及器材（1）标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清白蛋白，配制成浓度为1mg/ml的溶液。

（2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液。

（三）操作1. 280nm的光吸收法（1）标准曲线的绘制：取8支试管，编号后按下表加入试剂。

管号试剂(ml)1 2 3 4 5 6 7 8标准蛋白质溶液0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水 4 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0蛋白质浓度（mg/m l）0 0.1250.250.3750.50.6250.751.OD280混匀，选用光程为1cm的石英比色杯，在紫外分光光度计280nm波长处以0号管调“零”分别测定各管溶液的光密度（OD280）。

以纵坐标为光密度值，横坐标为蛋白质浓度绘出标准曲线。

（2）样品测定：取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

2．280nm和260nm的吸收差法将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2 ~2.0之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶液作空白对照，分别测得待测样品的光密度值（OD280和OD260）。

应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。