扫描电镜制样

冷冻扫描电镜制样方法及其在含水样品中的应用
莫家媚;张少鸿;卢思;付娟;陈晓丽;苏秋成
【期刊名称】《电子显微学报》
【年(卷),期】2024(43)2
【摘要】常规扫描电镜要求所观察的样品必须干燥、无水,而一些含水样品在干燥过程中会发生结构变化,无法真实反映样品的结构信息。

冷冻扫描电镜无需对样品进行干燥处理,可以直接分析含水样品表面、界面和内部结构,是研究高度含水样品的强有力工具。

样品的制样方法在冷冻扫描电镜技术中占有重要地位,它直接关系到样品真实形貌特征的反映和对超微结构的正确解读。

本文综述了冷冻扫描电镜的制样方法,并阐述冷冻扫描电镜技术在天然气水合物、微生物、乳液、水凝胶、动植物等含水样品中的应用。

【总页数】9页(P231-239)
【作者】莫家媚;张少鸿;卢思;付娟;陈晓丽;苏秋成
【作者单位】中国科学院广州能源研究所广东省新能源和可再生能源研究开发与应用重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R944.5;R94;R98;Q336
【相关文献】
1.生物样品的扫描电镜制样干燥方法
2.泥页岩样品自然断面与氩离子抛光扫描电镜r制样方法的比较与应用
3.一种新型冷冻样品台的构建及其在植物样品扫描电镜观
测中的应用4.高压冷冻及冷冻替代样品制备方法在体扫描电镜中的应用5.扫描电镜中半导体制冷冷台使用条件优化及在高含水量样品中的应用
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扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。

二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

后固定：1% 锇酸固定液，固定1-2小时。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。

＊整个过程，样品不要暴露于空气。

1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。

四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。

五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。

用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。

玻片过大或者过厚影响观察效果。

2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。

3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。

离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。

样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。

4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。

将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。

（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。

5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。

扫描电镜冷冻制样及传输系统(Cryo-SEM)的应用常规扫描电镜的样品室为高真空(10-3Pa)环境，要求观察的样品干燥无挥发，而一些样品在干燥过程中会发生结构变化(如囊泡等自组装结构、凝胶、生物样品等)，致使无法观察其真实结构，扫描电镜的低温冷冻制样及传输技术(Cryo-SEM)可实现对液体、半液体及对电子束敏感样品的观察。

1. 扫描电镜冷冻制样及传输系统简介冷冻扫描电镜的制样过程分为冷冻固定、冷冻断裂、升华及导电性喷涂，首先是将样品进行冷冻固定，冷冻固定过程尽量保持样品的结构，使水在固化的过程中不结晶而成为玻璃态的水，这样水的体积不会膨胀从而不会破坏样品的原始结构，通常采用高压冷冻的方法和液氮泥快速冷冻方法。

高压冷冻方法是在2100个大气压的压力下用液氮将样品冷冻，在此条件下水呈玻璃态。

液氮泥是将液氮置于真空环境(约0.1Pa)，此时液氮为“泥”状，不沸腾，可快速冷冻样品，减少样品中水结晶的可能。

冷冻固定后的液态样品，经特殊的装置在真空且低温(-100℃)的环境下将样品断裂，露出新鲜的断面，然后在真空且温度为-90℃的条件下，水进行升华，将包裹样品的水升华后，进行导电性喷涂(一般喷Pt)。

至此，冷冻制样工作完成，即可将样品通过冷冻传输系统置于扫描电镜的冷台上（温度可低至-160℃）进行观察。

图1是分析测试中心电镜室配置的扫描电镜冷冻制样及扫描电镜的冷台(配置于扫描电镜S-4300)，包括高压冷冻仪(及我们自行研制的液氮泥冷冻装置)、冷冻断裂及喷涂仪、真空冷冻传输装置及扫描电镜中的冷台。

高压冷冻冷冻断裂/喷涂真空冷冻传输Cryo-SEM图 1. 扫描电镜冷冻制样及传输系统的组成2.冷冻扫描电镜(cryo-SEM)的应用实例图2为酵母细胞(由酵母粉加水发酵制得)分别经高压冷冻和直接液氮冷冻制样，然后冷冻断裂并进行导电性喷涂后置于扫描电镜中观察到的结构，可以看出两种制样方法都可观察到不同截面断裂的酵母细胞，高压冷冻的制样方法较完整的保持了酵母细胞的结构，而直接投入液氮冷冻的方法使得酵母细胞的结构受挤压发生变形。

扫描电镜制样篇--金相样品发布者：飞纳电镜所谓“相”就是合金中具有同一化学成分、同一结构和同一原子聚集状态的均匀部分。

不同相之间有明显的界面分开。

合金的性能一般都是由组成合金的各相本身的结构性能和各相的组合情况决定的。

合金中的相结构大致可分为固溶体和化合物两大基本类型。

所谓“金相”就是金属或合金的相结构。

为了获得金属材料的真实显微组织并准确地观察、记录、测量和分析，合理有效的样品制备是至关重要的。

金相分析作为检验分析材料的手段之一，旨在揭示材料的真实结构。

要进行金相分析，就必须制备能用于微观观察检验的样品——金相试样。

金相样品制备与制备人员操作经验密切相关，制备人员的水平决定了试样的制备质量。

金相样品的制备通常分为五个步骤：取样、镶嵌、研磨、抛光和腐蚀，其中镶嵌和腐蚀是选择性的。

取样取样是金相试样制备的第一道工序，若取样不当，则达不到检验目的。

经验表明，金相试样最适宜的尺寸是直径为12mm，高为10mm的圆柱体，或底面为12mm×12mm，高为10mm的正方柱体。

试样太小难于把控不便磨制；太大会使磨制平面过大，既不易磨平又增加了磨制时间。

一般来说，试样首先采用火焰切割，空心钻取或者其他类似方法从大块材料中取出来，然后再送到相应的分析检测实验室进行最终切割。

实验室常用的切割手段有砂轮切割和线切割。

砂轮切割是一种常用的切割手段，当切割冷却不充分时，在试样表面一定深度内，由于局部受热而使组织发生变化，甚至产生相变，尤其以钢最易发生。

一般认为，线切割比砂轮切割更保险，可以将试样做得很薄，磨削也比较容易。

其实不然，线切割同样会对试样表面产生灼伤，只是线切割产生的灼伤是由电火花爆燃形成的点状。

如果打磨不彻底的话，此假象很可能会误判为材料的孔洞或疏松，尤其是铸态的样品。

镶嵌在实际的检测工作中，由于被检测试样的大小和形状各异，往往难以切成符合金相试样的尺寸要求（如颗粒样品，脆性样品），此时需要对试样进行镶嵌。

扫描电镜的微生物样品制备方法谢家仪,董光军,刘振英(中国科学院微生物研究所,北京100080)微生物样品的扫描电镜观察广泛地应用于微生物学研究的各领域。

为微生物资源的利用,微生物生物技术、遗传工程、环境保护等提供了大量直观的,有科研价值的形态学依据。

大多数微生物样品体积微小,使样品制备,尤其是临界点干燥,离子溅射等难于操作。

积多年微生物制样的经验,我们介绍微生物中有代表性的细菌,霉菌的制样技术,其他微生物样品均可参照处理。

1 细菌取液体或固体培养基中培养20h 左右、旺盛生长的菌体。

(1)收集菌体:¹液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm 离心3~5min,弃上清,倒入215%戊二醛固定液;º固体培养基上的菌体,可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。

将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。

(2)固定,脱水按常规方法。

215%戊二醛,2~4h y 磷酸缓冲液清洗3次y 1%锇酸4~6h y 缓冲液清洗3次y 乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20min P 次y 乙酸异戊酯置换2次,20min P 次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。

(3)临界点干燥:普通定性滤纸裁成35mm @18mm 的纸条,将长边35mm 平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。

将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。

放入临界点干燥器样品室,进行CO 2临界点干燥。

一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO 2置换2~3次)。

(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。

碳导电胶带一面粘在1P 4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。

扫描电镜细胞样品制备步骤嘿，咱今儿就来讲讲扫描电镜细胞样品制备那些事儿哈！
你想想看，细胞那么小的玩意儿，咱要想好好观察研究它们，可得下一番功夫呢！就像咱要给一个小娃娃打扮得漂漂亮亮去参加重要活动一样。

首先呢，得把细胞好好地收集起来。

这就好比去果园摘果子，得小心翼翼地把果子从树上摘下来，不能弄伤了它们。

咱得用合适的方法把细胞从它们生长的地方轻轻地取出来，可不能太粗鲁啦！
然后呢，就是给细胞洗个澡啦！把它们身上那些不需要的杂质啥的都洗掉，让它们干干净净的。

这就像是咱自己洗澡一样，把身上的脏东西都洗掉，清清爽爽的。

接下来，就是固定啦！这可重要得很呢！就好像给细胞穿上了一件坚固的铠甲，让它们能保持住自己的形态，不会东倒西歪的。

不然等会儿咱观察的时候，它们都变形了，那可咋整呀！
再之后，就是脱水啦！把细胞里面多余的水分都去掉，就像咱把湿漉漉的衣服晾干一样。

这一步可得仔细着点儿，不能让细胞受损哦！
接着呢，是干燥啦！让细胞处在一个干燥舒适的环境里，这样它们才能好好地被我们观察呀！
再往下，就是镀膜啦！这就好像给细胞披上了一层神秘的外衣，让它们在电镜下能更好地显现出来。

最后，就可以把制备好的细胞样品放到扫描电镜里面去观察啦！哇塞，你能想象到吗，通过电镜看到细胞的那一刻，就好像打开了一个微观世界的大门，里面有着无数的奥秘等着我们去探索呢！
你说这是不是很神奇呀？咱通过这一步步的操作，就能看到细胞的各种奇妙之处啦！所以呀，可别小瞧了这扫描电镜细胞样品制备的步骤哦，每一步都马虎不得呢！咱得像对待宝贝一样精心地去处理这些细胞，这样才能得到最准确、最有价值的观察结果呀！这可不是闹着玩的事儿呢！大家可得认真对待哟！。

细菌样品冷冻干燥制样方法
1) 取样：取大量样品离心（转速3000r~4000r），去除上清液，加入适当PH（7.2~7.4）的0.1 M PBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。

2) 固定：2.5%戊二醛固定3h（此步时间非绝对，1~12h都可），用PBS清洗两遍，每遍10min。

再用纯水清洗两遍。

3) 梯度脱水：用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，之后在100%乙醇的水溶液中脱水15min×2 次；再将样品置于乙醇和叔丁醇1:1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中15min×2次。

（此步也可以尝试不做）4) 冷冻干燥：滴加处理好的样品于5*5 mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。

5) 电镜观察：样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。

2.5%戊二醛：
Step 1:
0.2M磷酸缓冲液的配制：（0.1M的就是稀释2倍）取50mL定容100mL
---------------------
磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克
双蒸馏水加至500毫升
pH调至7.4
Step 2:
戊二醛固定液的配制：
---------------------
25% 戊二醛1ml
双蒸馏水4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液5ml
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4。

相关仪器的信息：透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号）TEM，产地：日本超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本真空喷镀仪：Eiko IB5 ion coater，产地：日本包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USATEM样品包埋块制作有关注意事项一、取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；3、组织块大小：一般要小于1mm3。

二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。

固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。

1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中2、使用锇酸的注意事项I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。

II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。

第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。

三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。

四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。

由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。

脱水过程中应注意：I 逐级脱水而不能急剧脱水；II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。

五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。

一、金属样品制备扫描电镜试样样品要求：样品不宜过大，过大的试样需要进行切割操作，切割后的样品经研磨、抛光和腐蚀后便可放到扫描电镜中直接进行观察。

切割设备：金属的切割设备选用沈阳科晶自动化设备有限公司生产的型号为SYJ-200外圆切割机，该设备切割金属时切割速度快，切割后的金属表面无热灼伤，表面形态好。

耗材：用来切割金属的一般有SiC 锯片（一般切割有色金属）、刚玉锯片（一般切割黑色金属）、全烧结金刚石锯片（适用于绝大多数材料）切割辅助设备：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的MTI-3040加热平台，该设备操作简单，温度≤200℃。

耗材：陶瓷树脂衬垫、石蜡试样的镶嵌：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的型号为CXQ-2500真空冷镶嵌机、HXQ-50自动热镶嵌机、XQ-2B 金相试样镶嵌机都可以作为金相实验镶嵌的设备。

耗材：镶料：胶木粉（热镶嵌）；水晶胶、硬性冷镶模、软性冷镶模、弹性样品夹（冷镶嵌）样品的磨抛：沈阳科晶自动化设备有限公司生产的手动研磨抛光机型号有UNIPOL-820、UNIPOL-830、UNIPOL-1210三种。

自动精密研磨抛光机型号有UNIPOL-810、UNIPOL-802、UNIPOL-1202、UNIPOL-1502四种。

自动压力研磨抛光机型号有UNIPOL-1000D、UNIPOL-1200S、UNIPOL-1200M、UNIPOL-800M、UNIPOL-12601材料固定MTI 加热平台2切割SYJ-200精密切割机3镶嵌HXQ-50自动热镶嵌机4研磨抛光UNIPOL-810精密研磨抛光机5清洗VGT-1620TD 超声波清洗机6溅射VTC-16-3HD 3靶等离子溅射仪7电子显微镜KYKY-EM8000场发射扫描电子显微镜8耗材SiC 锯片、刚玉锯片、全烧结金刚石锯片、陶瓷树脂衬垫、石蜡、胶木粉（热镶嵌）；水晶胶、硬性冷镶模、软性冷镶模、弹性样品夹（冷镶嵌）砂纸、金刚石磨片、树脂基金刚石磨片、研磨纸、研抛底片、磨料、抛光垫、抛光液、抛光膏、磁力橡胶五种。

扫描电镜检测的步骤及方法一、技术简介扫描电镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，它具有制样简单、放大倍数可调范围宽、图像的分辨率高、景深大等特点。

近年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、等学科的领域中。

主要是通过发射电子聚焦光束来扫描样品的表面形态.电子束与样品表面的样子发生作用，产生多种能够被检测的信号，这些信号就包含了样品的表面形态和组成染色。

二、实验流程1. 样品的初步处理a. 取材样品面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。

对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面。

b. 样品的清洗(1)用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；(2)用5%的苏打水清洗；(3)用超声震荡或酶消化的方法进行处理。

c. 固定：固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。

由于样品体积较大，固定时间应适当延长。

也可用快速冷冻固定。

d. 脱水：样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。

2. 样品的干燥a. 空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。

这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。

因此，该方法一般只适用于表面较为坚硬的样品。

b. 冷冻干燥法(1)置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。

常用的冷冻保护剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%-40%甘油水溶液。

(2)骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150℃的氟利昂冷冻剂中，使样品中的水分很快冻结。

(3)干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几小时或数天后，样品即达到干燥。

本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。

扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。

二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。

＊整个过程，样品不要暴露于空气。

1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。

四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。

五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。

用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。

玻片过大或者过厚影响观察效果。

2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。

3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。

离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。

样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。

4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。

将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。

（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。

5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。

磷酸盐缓冲液(PBS)a.磷酸盐缓冲液（0.2M）甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液Na2HPO42H2O 35.61g (Na2HPO47H2O) 53.65g (Na2HPO412H2O) 71.64g NaH2PO4H2O 27.60g ( NaH2PO42H2O) 31.21g加蒸馏水溶解成1000ml 加蒸馏水溶解成1000ml按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液0.2M磷酸盐缓冲液的配制将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。

昆虫扫描电镜样品制作中的若干问题甘雅玲，郭中伟!（中国科学院动物研究所，北京!"""#"）!通讯作者随着扫描电镜的发展及分辨率的不断提高，要求标本制作的技术也越来越高，目前，很多珍贵的标本由于制作不当而得不到较好的结果，细微结构反应不出来或存在人为假象，有的标本观察后照片水平低不能发表，针对特殊标本（模式标本）看完后可以还原等，诸如此类的问题，对昆虫标本的制作我们进行了多年的探究，并找到一些有效的解决办法供参考。

!标本的处理方法昆虫标本体表存在着许多污物，而扫描电镜主要观察的是标本的表面结构，因而就会出现结构的模糊和细节的疏漏。

对此，我们先将标本用生理盐水（昆虫用"$%&’()*+溶液）反复冲洗，如表面为硬壳可用细毛笔轻轻刷洗数次，如是软膜状组织可用,’戊二醛固定后，放入微型超声波清洗器中处理（功率&"-）!./012，就可以洗去表面附着的污物，并随时在解剖镜下检查是否干净，如果不干净可用注射器吸溶液多次冲洗，对于表面的黏液、脂肪和蛋白质类物可用石油醚或不同的蛋白酶处理。

"样品放电现象的处理观察昆虫标本有时会出现样品放电现象。

放电的主要原因是样品镀金不均或太薄。

为了避免放电，昆虫样品镀金厚度应在!&.3"20之间。

为使金离子均匀喷镀在样品表面，应采用在!4!"5&678左右的真空中/"9旋转喷镀或用离子溅射仪溅射。

如果样品表面有很多的绒毛、刺、棘鳞，应将样品放入!’的碘化钾溶液中浸泡3天，取出后用蒸馏水清洗，自然干燥后再喷金，这样样品的观察效果会更好。

#细胞、精子等样品的制作血细胞和精子等样品必须先用!’的磷酸缓冲液洗涤数次。

所用缓冲液应配为等渗的以免细胞变形。

另外，血细胞应加抗凝剂，缓冲液要用!&"":;012来分离。

精子应先用缓冲液将其稀释，再离心提纯，去除黏液和杂质。