第六章扫描电子显微镜的样品制备技术
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扫描电镜制样
扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。
二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。
取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。
三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。
四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。
2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。
样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。
如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。
3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。
4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。
5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。
6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
扫描电镜SEM样品制备
主要优点： 景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物 样品的各种形貌特征。
二、实验用品
1. 材料
2.
植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。
3. 2. 试剂
4.
丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％锇酸、
磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导
电胶等。
5. 3. 器材
6.
扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
• 排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量 计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些 更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降 到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀 膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。
临界点干燥操作时的注意事项： • 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 • 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
二、实验用品
1. 材料
2.
植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。
3. 2. 试剂
4.
丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％锇酸、
磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导
电胶等。
5. 3. 器材
6.
扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
• 排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量 计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些 更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降 到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀 膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。
临界点干燥操作时的注意事项： • 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 • 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
扫描电镜样品制备生物技术
金属原子 “辉光放电” 不同角度覆盖样品表面
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
扫描电镜样品制备
防止污染和氧化
保持清洁
在制样过程中，要保持样品和工具的清洁，避免引入污染物。
真空保存
将制备好的样品存放在真空环境中，以防止氧化和污染。
使用惰性气体
在需要的情况下，可以使用惰性气体（如氮气或氩气）来保护样 品，避免其与空气中的氧气或水分发生反应。
控制温度和湿度
恒温环境
在制样过程中，要保持恒定的温度，避免温度波 动对样品造成影响。
处理
对于某些难以清洁的样品，可以采用 适当的化学或物理方法进行处理，如 超声清洗、离子溅射等。处理后的样 品应保持干燥，避免受潮或污染。
02
扫描电镜制样方法
机械切割法
锯切
抛光
适用于较厚样品的初步切割，使用金 刚石锯片，注意控制切割速度和冷却 液的使用。
提高样品表面光洁度，常用抛光布和 抛光液，注意抛光时间和抛光液的选 择。
稳定性
样品在电子束轰击下应保持稳定， 不产生明显的形变或化学反应。
样品尺寸与形状
尺寸
通常要求样品尺寸在扫描电镜的 样品台范围内，一般直径不超过 30mm，厚度不超过5mm。
形状
样品形状应尽量规则，避免存在 尖锐边角或突出部分，以便于放 置在样品台上并保证成像质量。
样品表面清洁处理
清洁
样品表面应清洁无污物，避免尘埃、 油脂等杂质影响成像质量。
磨削
用于进一步减小样品尺寸和去除表面 粗糙度，可使用砂纸、砂轮等磨具， 注意选择合适的磨料粒度和冷却液。
化学腐蚀法
酸蚀
利用酸溶液对样品的腐蚀作用， 去除表面氧化物和污染物，注意 选择合适的酸溶液浓度和腐蚀时
间。
碱蚀
利用碱溶液对样品的腐蚀作用， 去除表面油脂和有机物，注意碱
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。
扫描电镜样品制备
实用文档
3.非导体样品的导电处理
由于电子束在样品表面作光栅状扫描，如果样品导电性能 不好，会在样品上聚集电荷放电，有时会损伤样品，直至烧毁。 一般生物样品不导电，因此必须对样品做导电处理，即喷镀一层 金属膜，一般膜厚为10~20nm。并根据样品表面凹凸粗糙状况及 样品性质而变化。有的样品需先喷碳再喷金。
（2）粘贴样品的材料：
粘贴动植物组织块样品最好使用导电胶，常用的有银河粉、石墨 粉等导电胶，对于要镀金观察的样品，通常用双面胶粘样；果壳、 种子等较大的样品可采用普通胶水粘样，注意等胶水自然干燥后 装样。
（3）注意事项：
粘贴样品需注意观察面朝上，并尽可能在水平面的同一高度上， 操作时要注意防尘、防潮和防止易飞散样品的相互混杂。
实用文档
5、样品的导电处理
（1）金属镀膜法：真空蒸汽喷镀、
离子溅射喷镀：
原理：产生离子束的独立装置被称 为离子枪，它提供一定的束流强度、 一定能量的Ar离子流。离子束以一定 的入射角度轰击靶材并溅射出其表层 的原子，后者沉积到衬底表面即形成 薄膜。在靶材不导电的情况下，需要 在离子枪外或是在靶材的表面附近， 用直接对离子束提供电子的方法，中 和离子束所携带的电荷。
③固定液浸没样品。
实用文档
2、脱水
（1）目的：用脱水剂取代样品中的游离水，以便进行干燥处理。
（2）脱水剂：乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅烷胺、 正丁醇等。
（3）脱水原理：用一种低表面张力的有机溶剂代换组织细胞中 的游离水，使样品在干燥时表面张力减少。
（4）对脱水的要求：不能引起结构变形；脱水要彻底。
4.保护样品研究面
扫描电镜的主要功能是做表面形貌观察或断面结构观察， 所以保护样品表面或断面的细微结构是一个十分重要的问题。在 清洗、固定、脱水、干燥、粘台等各个处理环节都不能触及或挤 压乃至损伤其观察面。
3.非导体样品的导电处理
由于电子束在样品表面作光栅状扫描，如果样品导电性能 不好，会在样品上聚集电荷放电，有时会损伤样品，直至烧毁。 一般生物样品不导电，因此必须对样品做导电处理，即喷镀一层 金属膜，一般膜厚为10~20nm。并根据样品表面凹凸粗糙状况及 样品性质而变化。有的样品需先喷碳再喷金。
（2）粘贴样品的材料：
粘贴动植物组织块样品最好使用导电胶，常用的有银河粉、石墨 粉等导电胶，对于要镀金观察的样品，通常用双面胶粘样；果壳、 种子等较大的样品可采用普通胶水粘样，注意等胶水自然干燥后 装样。
（3）注意事项：
粘贴样品需注意观察面朝上，并尽可能在水平面的同一高度上， 操作时要注意防尘、防潮和防止易飞散样品的相互混杂。
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5、样品的导电处理
（1）金属镀膜法：真空蒸汽喷镀、
离子溅射喷镀：
原理：产生离子束的独立装置被称 为离子枪，它提供一定的束流强度、 一定能量的Ar离子流。离子束以一定 的入射角度轰击靶材并溅射出其表层 的原子，后者沉积到衬底表面即形成 薄膜。在靶材不导电的情况下，需要 在离子枪外或是在靶材的表面附近， 用直接对离子束提供电子的方法，中 和离子束所携带的电荷。
③固定液浸没样品。
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2、脱水
（1）目的：用脱水剂取代样品中的游离水，以便进行干燥处理。
（2）脱水剂：乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅烷胺、 正丁醇等。
（3）脱水原理：用一种低表面张力的有机溶剂代换组织细胞中 的游离水，使样品在干燥时表面张力减少。
（4）对脱水的要求：不能引起结构变形；脱水要彻底。
4.保护样品研究面
扫描电镜的主要功能是做表面形貌观察或断面结构观察， 所以保护样品表面或断面的细微结构是一个十分重要的问题。在 清洗、固定、脱水、干燥、粘台等各个处理环节都不能触及或挤 压乃至损伤其观察面。
第六章扫描电子显微镜的样品制备技术
在冷冻干燥过程中，样品中的水分直接由冰态升 华为气态，样品也不受表面张力的影响。但这种 方法也有不足之处，如：样品中的水分易形成冰 晶而破坏超微结构。因此需要大量的冷冻剂和较 好的真空装置，使造价提高。再加上所需冷冻时 间过长，更限制了这种方法的使用。所以，尽管 用这种方法能较好地保存样品中的水溶性和脂溶 性 物质，但是使用仍不普遍。有下面两种方法：
第六章 扫描电子显微镜的
样品制备技术
6.1 SEM样品制备的基本要求
SEM对样品基本要求：
基本性质：干净、干燥、导电、不发光、 不发热、磁性弱。
大 小：直径最大不宜超过10 mm， 高度在3-5 mm之间，在满足观察的情 况下，样品尽量小为宜。
对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小 要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺 寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 Φ 3 ～ 5mm ， 大的样品座为 Φ 30 ～ 50mm ，以分别用来放置不同 大小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 ～ 10mm 左右。
表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前 提下进行适当清洗，然后干燥。
新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破 坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需 要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵 蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。
要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥 除去水分。
对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场 的影响。
要求导电，不导电的观察前进行导电处理。
6.1.2块状试样的制备
块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。 对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品 座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导 电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电 镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的 材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一 层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。 并可防止试样的热损伤。
第六章 扫描电子显微镜的
样品制备技术
6.1 SEM样品制备的基本要求
SEM对样品基本要求：
基本性质：干净、干燥、导电、不发光、 不发热、磁性弱。
大 小：直径最大不宜超过10 mm， 高度在3-5 mm之间，在满足观察的情 况下，样品尽量小为宜。
对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小 要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺 寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 Φ 3 ～ 5mm ， 大的样品座为 Φ 30 ～ 50mm ，以分别用来放置不同 大小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 ～ 10mm 左右。
表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前 提下进行适当清洗，然后干燥。
新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破 坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需 要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵 蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。
要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥 除去水分。
对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场 的影响。
要求导电，不导电的观察前进行导电处理。
6.1.2块状试样的制备
块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。 对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品 座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导 电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电 镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的 材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一 层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。 并可防止试样的热损伤。
扫描电子显微镜样品的制备
扫描电子显微镜样品的制备
样品制备技术的重要性
样品制备工作是电镜工作中最繁重、最艰 难的工作，又是最重要的环节，熟悉和掌握样 品制备技术是应用电镜来解决问题的首要条件。 根据电镜的类型、研究目的和样品类型及状态 的不同，相应采用不同的制样方法。制样方法 的选择和制样过程的技术控制将直接影响观察 和分析的结果。
高真空扫描电镜样品制备
1. 粉末样品的制 备 湿法:用适合 的分散剂在超声波 清洗器中分散
干法:适宜于不易团聚的样品
2. 块状样品的制备
将欲观察样品的有规律地粘结在样品台上
特殊表面处理--表面蚀刻
表面蚀刻是SEM样品制备的重要方法之一。特别适用于 对大块样品内部的结构形态和多相复合体系的相分布研究。 蚀刻法样品制备主要是基于如下原理：即利用蚀刻剂 与样品中不同组份或不同结构区域之间相互作用速率或程 度的不同，因而可以有选择或优先地溶解或破坏其中的某 一相或组份而保留下另一相或组份。 因此，蚀刻法可用于研究高聚物的结晶形态，以及共 混或填充高聚物中的相分布状态和各相之间的相互作用状 况；无机复合材料的相结构形态等。
送检样品须知
1.送检样品必须为干燥固体、块状、片状、 纤维状及粉末状均可。 2.应有一定的化学、物理稳定性，在真空 中及电子束轰击下不易分解、挥发或变 形。 3.样品无腐蚀性、放射性和磁性。
选择不同的制样方法：电镜的类型(扫描电镜,
透射电镜,电子探针) 要求, 研究目的, 样品类型
形貌观察 1.环境扫描电镜二次电子图像观察的样品制备 2.高真空扫描电镜二次电子图像观察的样品制备 3.背散射电子图像观察的样品制备 成分分析 X射线微区分析的样品制备技术 结构分析 背散射电子衍射的样品制备技术
41
图1. HIPS树脂SEM 像 (早期文献 照片），溶剂 蚀刻， 可见 橡胶相被溶解 后留下的空隙
样品制备技术的重要性
样品制备工作是电镜工作中最繁重、最艰 难的工作，又是最重要的环节，熟悉和掌握样 品制备技术是应用电镜来解决问题的首要条件。 根据电镜的类型、研究目的和样品类型及状态 的不同，相应采用不同的制样方法。制样方法 的选择和制样过程的技术控制将直接影响观察 和分析的结果。
高真空扫描电镜样品制备
1. 粉末样品的制 备 湿法:用适合 的分散剂在超声波 清洗器中分散
干法:适宜于不易团聚的样品
2. 块状样品的制备
将欲观察样品的有规律地粘结在样品台上
特殊表面处理--表面蚀刻
表面蚀刻是SEM样品制备的重要方法之一。特别适用于 对大块样品内部的结构形态和多相复合体系的相分布研究。 蚀刻法样品制备主要是基于如下原理：即利用蚀刻剂 与样品中不同组份或不同结构区域之间相互作用速率或程 度的不同，因而可以有选择或优先地溶解或破坏其中的某 一相或组份而保留下另一相或组份。 因此，蚀刻法可用于研究高聚物的结晶形态，以及共 混或填充高聚物中的相分布状态和各相之间的相互作用状 况；无机复合材料的相结构形态等。
送检样品须知
1.送检样品必须为干燥固体、块状、片状、 纤维状及粉末状均可。 2.应有一定的化学、物理稳定性，在真空 中及电子束轰击下不易分解、挥发或变 形。 3.样品无腐蚀性、放射性和磁性。
选择不同的制样方法：电镜的类型(扫描电镜,
透射电镜,电子探针) 要求, 研究目的, 样品类型
形貌观察 1.环境扫描电镜二次电子图像观察的样品制备 2.高真空扫描电镜二次电子图像观察的样品制备 3.背散射电子图像观察的样品制备 成分分析 X射线微区分析的样品制备技术 结构分析 背散射电子衍射的样品制备技术
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图1. HIPS树脂SEM 像 (早期文献 照片），溶剂 蚀刻， 可见 橡胶相被溶解 后留下的空隙
扫描电子显微镜样品制备技术
扫描电子显微镜样品制备技术韩玉泽扫描电子显微镜样品制备技术扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子,一般扫描电镜图象均为二次电子图象.由于扫描电镜具有高分辨率,景深长等特点,故其图象层次丰富,立体感强,可显示细胞和组织的三维结构形貌,故广泛应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察.近年来,扫描电镜所取得的迅速发展表明,仪器本身性能如分辨力和多功能等的不断提高固然重要,但样品制备技术的改良和日趋完善,对扫描电镜的应用与发展确实起到了积极促进作用,因此样品制备的质量,是直接决定扫描电镜能否发挥最佳性能并排除理想图片的关键所在.所以,自1966 年第一台商品扫描电镜诞生以来,扫描电镜样品制备技术问题,一直是电镜工作者们苦心钻研,不断创新的一个重要领域扫描电镜生物样品制备的基本要求生物样品与金属﹑矿物材料不同,它具有质地柔软,容易变形﹑导电性能差﹑二次电子发射率底以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点.因此,在对于高真空状态下的生物针对生物样品的特殊性,在进行扫描电镜样品制备时,一般要掌握以下原则:(一)每一操作过程,都应注意防止对样品的污染和损伤,使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构.(二)去除样品内水份,以利于维持扫描电镜的真空度和防止对镜(三)降低样品表面的电阻率,增加样品的导电性能,以提高二次电子发射率,建立适当的反差和减少样品的充放电效应.(四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造,都应注意确认和保护样品的观察面.二、SEM生物样品制备的基本操作程序在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品）需要采用某些特殊制备技术者（如管道铸型扫描、低电压观察法等）以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。
SEM生物样品制备的基本程序（一）取材SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。
扫描电镜样品制备技术教学
扫描电子显微镜样品制备
1 常规样品制备技术 2 冷冻割断技术 3 离子蚀刻技术 4 铸型技术 5 聚焦离子束技术
扫描电镜是研究样品的表面结构， 要求样品的表面不变形、无污染、导电 好、干燥好，结构清晰、无损坏。
对于金属样品或较硬的组织来说样
品处理比较简单。对于生物的软组织来 说，就需要进行较为复杂的样品处理过 程。
5×5×3mm3为 宜。
2 清洗 对要观察的组织表面用缓冲液
或生理盐水进行快速冲洗，除掉表面 的粘液、组织液、血液等附着物，尽 量将组织表面清洗干净，以利于电镜 观察。对于载玻片上的培养细胞要注 意冲洗力量，防止细胞脱落。对于难 以冲掉的附着物，也可在固定后仔细 冲洗。
3 固定 将清洗好的组织迅速放入2%戊
冰冻干燥法： 乙醚，液氮冷冻，真空干燥。
乙腈真空干燥法： 脱水后的组织进行50%，70%， 90% ，100%乙腈置换，各15分钟， 然后放入真空镀膜台的膜：
离子镀膜（溅射镀膜）：
其他样品制备方法
1 冷冻割断法： 2 离子蚀刻法： 3 铸型技术： 4 离子聚焦束IFB
下面主要介绍生物组织的样品制备 技术。
生物样品的常规处理方法
1 取材 2 表面结构的清洗、暴露 3 组织固定 4 组织脱水 5 组织干燥 6 组织表面导电处理 7 组织干燥保存
1 取材 取材速度要快，刀片要锋利，
避免组织挤压，将要观察的区域 用刀片切开暴露，组织块可大至 40×4 0×10mm3,一般
二醛固定液中2小时，0.1M磷酸缓 冲液清洗5分钟，然后放入 1%的锇 酸中后固定液1小时， 0.1M磷酸缓 冲液清洗5分钟。
4 组织脱水
固定好的组织清洗后用 酒精或丙酮进行梯度脱水， 30%， 50%，70%， 90%， 100%各15分钟。
1 常规样品制备技术 2 冷冻割断技术 3 离子蚀刻技术 4 铸型技术 5 聚焦离子束技术
扫描电镜是研究样品的表面结构， 要求样品的表面不变形、无污染、导电 好、干燥好，结构清晰、无损坏。
对于金属样品或较硬的组织来说样
品处理比较简单。对于生物的软组织来 说，就需要进行较为复杂的样品处理过 程。
5×5×3mm3为 宜。
2 清洗 对要观察的组织表面用缓冲液
或生理盐水进行快速冲洗，除掉表面 的粘液、组织液、血液等附着物，尽 量将组织表面清洗干净，以利于电镜 观察。对于载玻片上的培养细胞要注 意冲洗力量，防止细胞脱落。对于难 以冲掉的附着物，也可在固定后仔细 冲洗。
3 固定 将清洗好的组织迅速放入2%戊
冰冻干燥法： 乙醚，液氮冷冻，真空干燥。
乙腈真空干燥法： 脱水后的组织进行50%，70%， 90% ，100%乙腈置换，各15分钟， 然后放入真空镀膜台的膜：
离子镀膜（溅射镀膜）：
其他样品制备方法
1 冷冻割断法： 2 离子蚀刻法： 3 铸型技术： 4 离子聚焦束IFB
下面主要介绍生物组织的样品制备 技术。
生物样品的常规处理方法
1 取材 2 表面结构的清洗、暴露 3 组织固定 4 组织脱水 5 组织干燥 6 组织表面导电处理 7 组织干燥保存
1 取材 取材速度要快，刀片要锋利，
避免组织挤压，将要观察的区域 用刀片切开暴露，组织块可大至 40×4 0×10mm3,一般
二醛固定液中2小时，0.1M磷酸缓 冲液清洗5分钟，然后放入 1%的锇 酸中后固定液1小时， 0.1M磷酸缓 冲液清洗5分钟。
4 组织脱水
固定好的组织清洗后用 酒精或丙酮进行梯度脱水， 30%， 50%，70%， 90%， 100%各15分钟。
电子显微镜的样品制备技巧
电子显微镜的样品制备技巧电子显微镜是一种强大的工具，可以帮助科学家们观察微观世界中的细节。
然而，为了获得高质量的显微图像，合适的样品制备技巧至关重要。
本文将介绍几种常见的电子显微镜样品制备技巧，并探讨它们的适用性和局限性。
一种常见的样品制备技巧是薄片制备。
通过使用特殊的切割工具，可以将宏观物体切割成透明的薄片。
然后，使用一系列的研磨和抛光过程，将薄片表面处理到光滑和平整。
最后，使用一台离心机，将薄片固定在网状铜网上。
这种技术适用于对材料的结构进行观察，如金属晶体学研究和纤维结构分析。
然而，薄片制备技术需要高超的技术，因为薄片的厚度必须控制在几个纳米到几十微米之间，否则会影响到显微图像的清晰度。
另一种常见的样品制备技巧是胶片法。
这种方法适用于对生物样品的观察，如细胞和微生物。
首先，将样品固定在玻璃片上，并使用特殊的切割工具将其切割成适当的尺寸。
接下来，将一层涂有特殊胶片的膜覆盖在样品上，并使用旋转机械将其均匀涂覆。
然后，将样品放入硬化剂中，使胶片硬化。
最后，使用刮刀将胶片刮下，并将其安装在电子显微镜的样品台上。
胶片法相对简单易行，适用于大量样品的制备。
然而，使用胶片也有一些缺点，例如可能会产生伪影或胶片残留。
还有一种常见的样品制备技巧是冷冻法。
这种技术适用于对生物样品进行高分辨率观察。
通过将样品快速冷冻到极低温度，可以避免样品中的水分子结冰并破坏其结构。
然后，使用特殊的设备，将样品表面上的冰层逐渐去除，直到暴露出内部的样品结构。
最后，将样品放入电子显微镜中观察。
冷冻法的优点是可以提供生物样品的最佳保护和结构分辨率，但也存在一些挑战，如样品处理的快速性和设备的复杂性。
除了上述提到的常见技巧外，还有一些其他的样品制备技巧，如离子切割法、磨削法和化学腐蚀法。
这些技术在特定的研究领域中得到广泛应用，可以提供不同类型样品的制备方法。
然而，无论采用哪种样品制备技巧，都需要谨慎操作，并且需要时常验证样品的质量和制备过程的可靠性。
仪器操作流程扫描电子显微镜的样品制备步骤
仪器操作流程扫描电子显微镜的样品制备步骤仪器操作流程扫描电子显微镜的样品制备步骤扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种高分辨率的显微镜，广泛应用于材料科学、生命科学、纳米技术等领域中的表面形貌和成分分析。
在使用SEM之前，样品的制备步骤十分重要，本文将介绍扫描电子显微镜样品制备的流程。
步骤一：样品选择和切割首先，根据实验需求选择合适的样品。
样品可以是均匀材料的薄片，也可以是复杂材料的小块或碎片。
对于均匀材料，可以使用切割机或者砂轮切割机将样品切割成适当大小的薄片。
对于复杂材料，可以使用砂纸和十字锯来切割。
切割时要注意选择合适的切割液、切割速度和切割角度，以避免样品损坏和变形。
步骤二：样品固定将切割好的样品放入合适的试管或者样品架中，使用合适的固定剂将样品固定。
常用的固定剂有蜡、树脂和聚合物等。
固定剂的选择要根据样品的性质和实验需求来确定。
对于坚硬的材料，可以使用聚合物来固定，对于易破碎的材料，可以使用蜡或树脂来固定。
步骤三：样品研磨和抛光为了获得平滑的样品表面，需要对样品进行研磨和抛光。
首先，使用粗砂纸或者砂轮对样品进行研磨，去除表面的粗糙度和切割痕迹。
然后，使用逐渐细化的砂纸或研磨液对样品进行抛光，直到获得所需的光洁度和平整度。
在抛光过程中，要注意使用合适的抛光液和抛光时间，避免过度抛光导致样品表面变形或者损坏。
步骤四：样品清洁抛光完成后，需要对样品进行清洁，以去除表面的杂质和污染物。
首先，使用去离子水或酒精将样品浸泡，去除表面的油脂和有机物。
然后，使用超声波清洗仪将样品进行超声波清洗，以去除较为顽固的污染物。
最后，用去离子水将样品冲洗干净，并用氮气吹干。
步骤五：导电涂层扫描电子显微镜需要样品具有良好的导电性能，因此需要对样品进行导电涂层。
常用的导电涂层材料有金、铂、银和碳等。
涂层可以使用喷雾法、溅射法或者真空蒸镀法来完成。
涂层过程中要注意涂层均匀度和厚度的控制，以确保样品的导电性能和显微观察效果。
电子显微镜样本制备技巧
电子显微镜样本制备技巧电子显微镜（Electron Microscope，简称EM）是一种先进的观察微观结构的科学仪器。
它利用电子束来取代传统光束，能够观察到更细微的细节和更高分辨率的图像。
然而，为了确保获得清晰、准确的显微图像，样品制备技术在整个过程中起着重要的作用。
本文将介绍一些电子显微镜样本制备的技巧。
1. 样品的选择和处理电子显微镜需要对样本进行处理和制备，以便在显微图像中显示所需的细微结构。
选择合适的样品是至关重要的。
常见的样品包括金属、陶瓷、聚合物等。
对于固体样本，通常需要将其切割成薄片。
这可以通过机械切割、离心切割或电解切割来实现。
切割的目的是获得漂亮的横截面，以便在显微图像中观察样本的内部结构。
对于液体样本，可以使用冷冻法制备样品。
这种方法通常适用于活细胞或液体溶液。
将样品放置在液氮中快速冷冻，然后用低温解冻的方法固定样品，以保持其原始的形态和结构。
这种方法避免了水分蒸发和伪影的产生，使得样本在电子显微镜下观察更加真实。
2. 样品的固定和包埋在样品制备过程中，固定和包埋样品是必不可少的步骤。
固定的目的是防止样品在观察过程中受到损伤或退化。
常用的固定剂有醛类（如戊二醛）和酸类（如伪牛磺酸）。
包埋是为了保护样品并使其适于电子显微镜的观察。
通常使用的包埋材料包括环氧树脂和聚苯乙烯。
包埋后的样品将被切割成薄片，并通过薄片的上下研磨和抛光的过程使得样品表面光滑。
3. 样品的薄化为了在电子显微镜下观察到样品的细微结构，样品必须足够薄。
样品的薄化是通过离聚焦离子束（Focused Ion Beam，简称FIB）技术实现的。
这种技术使用离子束来磨削样品表面，使其变得足够薄。
离聚焦离子束通过在样品表面进行扫描来磨削样品。
扫描的过程通常需要一定的时间和精细调整。
在薄化过程中，需要控制好离子束的能量和角度，以克服离子束对样品造成的热效应和表面损伤。
4. 样品的导电涂层在电子显微镜观察过程中，样品必须是导电的。
扫描电子显微镜样品制备
3.3 生物样品制备
超薄切片实际上是样品的二维切片，不能表达细胞 的三维结构，而且在观察切片后所拍摄的显微照片 时，容易造成错误的印象，用扫描电子显微镜(SEM) 能直接观察标本表面的三维空间结构，真实地反映 各种细胞表面和断裂面的形态特征。 扫描电镜细胞样品的预处理包括取材、固定、脱水 等。 扫描电镜要求完整且清洁表面，但是在许多样品的 表面常附有粘液、血液、组织液及灰尘等杂物，妨 碍着观察，以致造成对图像的错误解释，所以，在 固定前都必须特别做好表面的清洁工作。
二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当 电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进 入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入， 所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且 它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差 别不大。
制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等 处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的 二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。
扫描电子显微镜样品制备
小组成员：裘英华，张国荣，薛晓波， 储钢，金志华
2010-1-6
扫描电镜相比透射电镜的一大优点：样 品制备简单。 但不意味着样品制备可以随意进行。忽 视样品制备，往往影响检测结果。
1.扫描电子显微镜原理
扫描电子显微镜的成像 是靠观察物体表面发射 的电子。扫描电子显微 镜是用聚焦电子束在样 品表面扫描。电子激发 样品表面的原子放电， 释放出微细的二次电子， 用检测装置可以捕获它 们，然后通过类似电视 机的原理将样品图象呈 现出来。
块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。 对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品 座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导 电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电 镜中观察。 对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先 进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜。 以避免电荷积累，影响图象质量。并可防止试 样的热损伤。
扫描电子显微镜样品的制备
优点 提高样品的耐受电子束轰击的能力 提高导电率 提高分辨率（２０Å） 加强固定效果 样品不易产生收缩或损伤，细胞器保存完整
环境扫描电镜样品制备
环境扫描电镜的样品室会通入气体或者水分而 处于低真空的“环境”状态，根据气体电离及 放大原理，非导体及含水样品可以不经表面喷 涂处理（喷金或喷碳）就能直接观察。 环境扫描电镜可以对各种固体和液体样品进行 形态观察和元素（C-U）定性定量分析，对部 分溶液进行相变过程观察。对于生物样品、含 水样品、含油样品，既不需要脱水，也不必进 行导电处理，可在自然的状态下直接观察二次 电子图像并分析元素成分。
止来自于样品组织内部的信息参与成像。
导电处理--真空镀膜法
原理：利用真空镀膜仪在高真空下使金属 加热到熔点以上时，蒸发成极细小的颗粒喷射 到样品上，由于金属的沉积使样品表面形成薄 金属膜。 缺点：金属颗粒粗，膜不均匀，操作费时。 目前较少使用，主要用于制碳膜、碳复型膜和 金属投影。
导电处理--离子溅射法
注意事项：
1、 由于扫描电镜对样品表面的要求非常严 格，必须清洗干净，否则，可导致观察困难或 错误判断。 2、取材时要做到“动作快、环境冷、部位 准”。固定前清洗的组织离体后应在2—3分钟 清洗完毕并投入固定液内；固定后清洗的组织 离体后应在1分钟以内投入固定液。固定液要 预冷，取材部位必须准确。 3、实验动物取材部位不宜多，否则会延误取 材时间，导致组织自溶等人为假象的发生。 4、植物样品在取了样品后要抽真空，使细胞 壁间隙的气体抽出，减少气压，有利于固定液 的渗透。
E.Coli
前固定后未彻底漂洗干净,背景为戊二醛结晶
背散射电子图像观察的样品制备
样品(粉末、块体)的准备与二次电子图像的样 品准备相似。 电子背散射图像由形貌衬度和原子序数两部分 叠加而成。如果样品表面表面存在不平整的现 象会造成了显微形貌有差异的区域，背散射电 子的产额减少，在图像中呈现暗区；但是样品 内的组成元素相差较远，其平均原子序数较高 的部位比平均原子序数较低的部位亮，通过这 一亮度上的差别，可以将原子序数低的区域和 原子序数高的区域明显区分。 由于背散射电子图像观察的样品与原子序数有 关，所以在喷镀处理时要记得不能采用喷金处 理，最好选择喷碳处理。
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表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前 提下进行适当清洗，然后干燥。
新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破 坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需 要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵 蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。
要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥 除去水分。
6.1.3粉体试样的制备
粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上， 用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用洗 耳球吹去粘结不牢固的颗粒。
对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时， 将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散，再 用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上，待液 体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附力即可 粘附在样品座上。
4 冷冻干燥：在此过程中，样品中的水分直接由冰态升 华为气态，样品也不受表面张力的影响。但这种方法 的不足之处是样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结 构。
6.2.3 临界点干燥
临界点：在一定的温度和压力下，某物质的液态和气态 界面消失，由液态瞬间转化为气态，此时的温度即该物 质 的 临 界 点 温 度 （ C.T ） ， 同 时 也 是 该 物 质 的 临 界 点 （C.P）。而此时的压力和该物质的密度称为临界压力和 临界密度。不同的物质有各自的临界点和临界压力。在 临界点时表面张力作用消失，分子之间的内聚力等于零。 临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。
脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止 样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。采用不 同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。
6.2.2 样品的干燥：
1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表 面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙 齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如 细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100％， 在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为 脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多 变形而影响其结构。
⑨导电 ：离子溅射、真空镀膜或导电染色处理
6.2.1固定与脱水
样品的固定：为了把生物样品的微细结构和外部形态真实的 保留下来，SEM样品必须进行固定处理。通过固定还可以使 组织硬化，从而增强样品在干燥过程中耐受表面张力变化发 生龟裂，还能提高样品耐受电子束轰击的能力。常用的固定 剂为醛类和四氧化锇，还有多聚甲醛和高锰酸钾等。固定的 方式有浸泡固定、灌注固定、微波和化学混合固定。
对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场 的影响。
要求导电，不导电的观察前进行导电处理。
6.1.2块状试样的制备
块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。 对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品 座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导 电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电 镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的 材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一 层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。 并可防止试样的热损伤。
2. 真空干燥法：是直接将固定及脱水的样品放入真空镀膜仪 内，在低真空状态下使样品内的溶液逐步挥发，当达到高真 空时样品即可干燥，随后进行金属镀膜。这一方法简单易行， 但是仍存在一定的表面张力问题，固在缺少其它的干燥手段 时才选用。
3 临界点干燥：目前最理想的简单的干燥法。临界点 干燥仪利用物质在临界状态下液体表面张力逐渐被消 除的特性，减少样品干燥过程中的变形和收缩，从而 达到样品的完全干燥。
在制备SEM样品时，必须掌握以下原则：
(1)每一操作过程，都应注意防止样品的污染和损伤， 使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构；
(2)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止 镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少避 免样品体积变小和收缩变形等人工假象；
(3)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以 提高二次电子发射率，建立适度的反差和减少样品的 充放电效应；
(4)观察组织细胞的表面或内部微结构，应注意和保护 样品的观察面。
6，切取适当大小的样品。专门的SEM备有 灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电 镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左 右。
②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态， 但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构， 使其不致因不慎的操作造成人为损伤。
第六章 扫描电子显微镜的
样品制备技术
6.1 SEM样品制备的基本要求
SEM对样品基本要求：
基本性质：干净、干燥、导电、不发光、 不发热、磁性弱。
大 小：直径最大不宜超过10 mm，高 度在3-5 mm之间，在满足观察的情况下， 样品尽量小为宜。
对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小 要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺 寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 Φ 3 ～ 5mm ， 大的样品座为 Φ 30 ～ 50mm ，以分别用来放置不同大 小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 ～ 10mm 左右。
③固定 用2.5～5％戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定。 具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟， 较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。
④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。
⑤重固定 1％锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定10～60min。有 时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如 随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合 使用。
⑥漂洗 用缓冲液洗去未结合的锇酸。
⑦脱水 用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100 ％、100％丙酮或乙醇溶液各10-15分钟，大于1mm的 样品可脱水10～20分钟。
⑧干燥 一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自 然干燥或45℃热风吹干。有些研究工作要求尽量完好 保存样品表面的精细结构，可用真空干燥法、冷冻干 燥法和临界点干燥法等使样品干燥。这些方法都比空 气干燥法效果好，其中临界点干燥法优点多，多被研 究工作者采用。
新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破 坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需 要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵 蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。
要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥 除去水分。
6.1.3粉体试样的制备
粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上， 用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用洗 耳球吹去粘结不牢固的颗粒。
对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时， 将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散，再 用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上，待液 体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附力即可 粘附在样品座上。
4 冷冻干燥：在此过程中，样品中的水分直接由冰态升 华为气态，样品也不受表面张力的影响。但这种方法 的不足之处是样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结 构。
6.2.3 临界点干燥
临界点：在一定的温度和压力下，某物质的液态和气态 界面消失，由液态瞬间转化为气态，此时的温度即该物 质 的 临 界 点 温 度 （ C.T ） ， 同 时 也 是 该 物 质 的 临 界 点 （C.P）。而此时的压力和该物质的密度称为临界压力和 临界密度。不同的物质有各自的临界点和临界压力。在 临界点时表面张力作用消失，分子之间的内聚力等于零。 临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。
脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止 样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。采用不 同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。
6.2.2 样品的干燥：
1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表 面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙 齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如 细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100％， 在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为 脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多 变形而影响其结构。
⑨导电 ：离子溅射、真空镀膜或导电染色处理
6.2.1固定与脱水
样品的固定：为了把生物样品的微细结构和外部形态真实的 保留下来，SEM样品必须进行固定处理。通过固定还可以使 组织硬化，从而增强样品在干燥过程中耐受表面张力变化发 生龟裂，还能提高样品耐受电子束轰击的能力。常用的固定 剂为醛类和四氧化锇，还有多聚甲醛和高锰酸钾等。固定的 方式有浸泡固定、灌注固定、微波和化学混合固定。
对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场 的影响。
要求导电，不导电的观察前进行导电处理。
6.1.2块状试样的制备
块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。 对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品 座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导 电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电 镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的 材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一 层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。 并可防止试样的热损伤。
2. 真空干燥法：是直接将固定及脱水的样品放入真空镀膜仪 内，在低真空状态下使样品内的溶液逐步挥发，当达到高真 空时样品即可干燥，随后进行金属镀膜。这一方法简单易行， 但是仍存在一定的表面张力问题，固在缺少其它的干燥手段 时才选用。
3 临界点干燥：目前最理想的简单的干燥法。临界点 干燥仪利用物质在临界状态下液体表面张力逐渐被消 除的特性，减少样品干燥过程中的变形和收缩，从而 达到样品的完全干燥。
在制备SEM样品时，必须掌握以下原则：
(1)每一操作过程，都应注意防止样品的污染和损伤， 使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构；
(2)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止 镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少避 免样品体积变小和收缩变形等人工假象；
(3)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以 提高二次电子发射率，建立适度的反差和减少样品的 充放电效应；
(4)观察组织细胞的表面或内部微结构，应注意和保护 样品的观察面。
6，切取适当大小的样品。专门的SEM备有 灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电 镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左 右。
②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态， 但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构， 使其不致因不慎的操作造成人为损伤。
第六章 扫描电子显微镜的
样品制备技术
6.1 SEM样品制备的基本要求
SEM对样品基本要求：
基本性质：干净、干燥、导电、不发光、 不发热、磁性弱。
大 小：直径最大不宜超过10 mm，高 度在3-5 mm之间，在满足观察的情况下， 样品尽量小为宜。
对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小 要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺 寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 Φ 3 ～ 5mm ， 大的样品座为 Φ 30 ～ 50mm ，以分别用来放置不同大 小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 ～ 10mm 左右。
③固定 用2.5～5％戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定。 具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟， 较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。
④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。
⑤重固定 1％锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定10～60min。有 时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如 随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合 使用。
⑥漂洗 用缓冲液洗去未结合的锇酸。
⑦脱水 用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100 ％、100％丙酮或乙醇溶液各10-15分钟，大于1mm的 样品可脱水10～20分钟。
⑧干燥 一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自 然干燥或45℃热风吹干。有些研究工作要求尽量完好 保存样品表面的精细结构，可用真空干燥法、冷冻干 燥法和临界点干燥法等使样品干燥。这些方法都比空 气干燥法效果好，其中临界点干燥法优点多，多被研 究工作者采用。