负染技术、扫描电镜样品制备技术

扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。

透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。

由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。

一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。

2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。

3.导电性能要好，应进行导电处理。

4.二次电子的发射率要高。

5.注意确认和保护样品的观察面。

尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。

(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。

2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。

3.取材部位要准确。

观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。

观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。

为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。

4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。

5.操作应在低温(0～4℃)下进行。

(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。

扫描电子显微镜样品制备技术韩玉泽扫描电子显微镜样品制备技术扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子,一般扫描电镜图象均为二次电子图象.由于扫描电镜具有高分辨率,景深长等特点,故其图象层次丰富,立体感强,可显示细胞和组织的三维结构形貌,故广泛应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察.近年来,扫描电镜所取得的迅速发展表明,仪器本身性能如分辨力和多功能等的不断提高固然重要,但样品制备技术的改良和日趋完善,对扫描电镜的应用与发展确实起到了积极促进作用,因此样品制备的质量,是直接决定扫描电镜能否发挥最佳性能并排除理想图片的关键所在.所以,自1966 年第一台商品扫描电镜诞生以来,扫描电镜样品制备技术问题,一直是电镜工作者们苦心钻研,不断创新的一个重要领域扫描电镜生物样品制备的基本要求生物样品与金属﹑矿物材料不同,它具有质地柔软,容易变形﹑导电性能差﹑二次电子发射率底以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点.因此,在对于高真空状态下的生物针对生物样品的特殊性,在进行扫描电镜样品制备时,一般要掌握以下原则:(一)每一操作过程,都应注意防止对样品的污染和损伤,使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构.(二)去除样品内水份,以利于维持扫描电镜的真空度和防止对镜(三)降低样品表面的电阻率,增加样品的导电性能,以提高二次电子发射率,建立适当的反差和减少样品的充放电效应.(四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造,都应注意确认和保护样品的观察面.二、SEM生物样品制备的基本操作程序在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品）需要采用某些特殊制备技术者（如管道铸型扫描、低电压观察法等）以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。

SEM生物样品制备的基本程序（一）取材SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。

基础实验——扫描电镜样品制备！扫描电子显微镜样品制备比透射电镜样品制备简单，不需要包埋和切片。

扫描电子显微镜样品的制备，必须满足以下要求。

关于生物样品的制备，中洪医学实验君主要给大家讲的是化学方法和冷冻方法！1样本要求扫描电子显微镜的优势为可以直接观察非常粗糙的样品表面，参差起伏的材料原始断口。

但其劣势为样品必须在真空环境下观察，因此对样品有一些特殊要求，笼统的讲：干燥，无油，导电。

1、形貌形态，必须耐高真空：例如有些含水量很大的细胞，在真空中很快被抽干水分，细胞的形态也发生了改变，无法对各类型细胞进行区分；2、样品表面不能含有有机油脂类污染物：油污在电子束作用下极端容易分解成碳氢化物，对真空环境造成极大污染。

3、样品必须保持充分干燥的状态，某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛发、昆虫、植物种子、花粉等，但图象质量差，而且观察和拍摄照片时须尽可能迅速。

4、样本需良好的导电性和较高的二次电子产额：对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。

5、特殊情况: 磁性材料，必须退磁。

对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。

2化学方法制备样品化学方法制备样品的程序通常是：清洗、化学固定、干燥、喷镀金属。

1、清洗：某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌、淋巴液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。

亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。

2、固定：通常采用醛类(主要是戊二醛和多聚甲醛)与四氧化锇双固定，也可用四氧化锇单固定。

四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。

这对高分辨扫描电子显微术是极端重要的。

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。