负染技术、扫描电镜样品制备技术

扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。

透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。

由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。

一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。

2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。

3.导电性能要好，应进行导电处理。

4.二次电子的发射率要高。

5.注意确认和保护样品的观察面。

尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。

(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。

2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。

3.取材部位要准确。

观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。

观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。

为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。

4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。

5.操作应在低温(0～4℃)下进行。

(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。

扫描电子显微镜样品制备技术韩玉泽扫描电子显微镜样品制备技术扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子,一般扫描电镜图象均为二次电子图象.由于扫描电镜具有高分辨率,景深长等特点,故其图象层次丰富,立体感强,可显示细胞和组织的三维结构形貌,故广泛应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察.近年来,扫描电镜所取得的迅速发展表明,仪器本身性能如分辨力和多功能等的不断提高固然重要,但样品制备技术的改良和日趋完善,对扫描电镜的应用与发展确实起到了积极促进作用,因此样品制备的质量,是直接决定扫描电镜能否发挥最佳性能并排除理想图片的关键所在.所以,自1966 年第一台商品扫描电镜诞生以来,扫描电镜样品制备技术问题,一直是电镜工作者们苦心钻研,不断创新的一个重要领域扫描电镜生物样品制备的基本要求生物样品与金属﹑矿物材料不同,它具有质地柔软,容易变形﹑导电性能差﹑二次电子发射率底以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点.因此,在对于高真空状态下的生物针对生物样品的特殊性,在进行扫描电镜样品制备时,一般要掌握以下原则:(一)每一操作过程,都应注意防止对样品的污染和损伤,使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构.(二)去除样品内水份,以利于维持扫描电镜的真空度和防止对镜(三)降低样品表面的电阻率,增加样品的导电性能,以提高二次电子发射率,建立适当的反差和减少样品的充放电效应.(四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造,都应注意确认和保护样品的观察面.二、SEM生物样品制备的基本操作程序在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品）需要采用某些特殊制备技术者（如管道铸型扫描、低电压观察法等）以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。

SEM生物样品制备的基本程序（一）取材SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。

基础实验——扫描电镜样品制备！扫描电子显微镜样品制备比透射电镜样品制备简单，不需要包埋和切片。

扫描电子显微镜样品的制备，必须满足以下要求。

关于生物样品的制备，中洪医学实验君主要给大家讲的是化学方法和冷冻方法！1样本要求扫描电子显微镜的优势为可以直接观察非常粗糙的样品表面，参差起伏的材料原始断口。

但其劣势为样品必须在真空环境下观察，因此对样品有一些特殊要求，笼统的讲：干燥，无油，导电。

1、形貌形态，必须耐高真空：例如有些含水量很大的细胞，在真空中很快被抽干水分，细胞的形态也发生了改变，无法对各类型细胞进行区分；2、样品表面不能含有有机油脂类污染物：油污在电子束作用下极端容易分解成碳氢化物，对真空环境造成极大污染。

3、样品必须保持充分干燥的状态，某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛发、昆虫、植物种子、花粉等，但图象质量差，而且观察和拍摄照片时须尽可能迅速。

4、样本需良好的导电性和较高的二次电子产额：对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。

5、特殊情况: 磁性材料，必须退磁。

对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。

2化学方法制备样品化学方法制备样品的程序通常是：清洗、化学固定、干燥、喷镀金属。

1、清洗：某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌、淋巴液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。

亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。

2、固定：通常采用醛类(主要是戊二醛和多聚甲醛)与四氧化锇双固定，也可用四氧化锇单固定。

四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。

这对高分辨扫描电子显微术是极端重要的。

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。

扫描电镜的样品制备
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种高分辨率的显微镜，对于复杂的样品结构、微观形态和表面形貌的分析非常有用。

然而，要获得良好的扫描电镜显像效果，样品的制备至关重要。

下面将介绍几种常用的扫描电镜样品制备技术。

1. 金属喷涂法
金属喷涂法是扫描电镜样品制备的经典方法。

该方法使用金属喷涂仪将金属颗粒喷在样品表面，使其形成一层均匀、导电性良好的金属膜，以便在扫描电镜中观察样品的表面结构。

该方法适用于非导电样品，如细胞、生物组织、聚合物等。

2. 离子切割法
离子切割法利用离子切割机将样品切割成纤细的薄片，以便于在扫描电镜中观察。

这种方法适用于非常薄的样品，如材料薄片、芯片等。

它可以提供非常高分辨率的图像，并且可以通过纵向切割获得样品的三维结构。

3. 冷冻切片法
冷冻切片法是一种用于生物样品的扫描电镜制备方法。

该方法使用超低温技术将样品冻结，并使用超薄刀片切割成极薄的切片，通常为50~200纳米。

这可以保留样品的水感性和原始形态，并使其在扫描电镜中观察更加清晰。

4. 化学蚀刻法
化学蚀刻法是用于金属样品的扫描电镜制备方法。

该方法使用酸或碱对样品表面进行蚀刻，以去除不需要观察的材料，形成清晰的样品结构。

该方法适用于金属薄膜、晶体和合金等金属材料。

总之，良好的扫描电镜样品制备是获得高品质扫描电镜图像的关键。

每种样品都有其独特的制备方法，为了获得最好的结果，在选择合适的制备方法时需要谨慎选择。

扫描电镜测试生物样品制备技术大多数生物样品都含有水分,而且比较柔软,因此,在进行扫描电镜观察前,要对样品作相应的处理。

扫描电镜样品制备的主要要求是:尽可能使样品的表面结构保存好,没有变形和污染,样品干燥并且有良好导电性能。

一.样品的初步处理(一取材样品面积可为8mm×8mm,厚度可为5mm。

对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等,可固定在滤纸或卡片纸上,以充分暴露待观察的组织表面。

(二样品的清洗用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面,即组织的游离面。

由于样品取自活体组织,其表面常有血液、组织液或粘液附着,这会遮盖样品的表面结构,影响观察。

因此,在样品固定之前,要将这些附着物清洗干净。

清洗的方法有以下几种:1.用等渗的生理盐水或缓冲液清洗;2.用5%的苏打水清洗;3.用超声震荡或酶消化的方法进行处理。

例如清洗肠粘膜表面的粘液,可用下面的方法:清洗液配方:透明质酸酶300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理盐水 100 ml清洗液的pH为5.5~6。

清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中,边浸泡边震荡30分钟,最后用双蒸水洗3次。

无论用哪种清洗方法,注意在清洗时不要损伤样品。

(三固定固定样品的常用试剂为戊二醛及锇酸双固定。

由于样品体积较大,固定时间应适当延长。

也可用快速冷冻固定。

(四脱水样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水,然后进入中间液,一般用醋酸异戊酯作中间液。

二.样品的干燥扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。

无论是水或脱水溶液,在高真空中都会产生剧烈地汽化,不仅影响真空度、污染样品,还会破坏样品的微细结构。

因此,样品在用电镜观察之前必须进行干燥。

干燥的方法有以下几种:(一空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法,就是将经过脱水的样品,让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。

这种方法的最大优点是简便易行和节省时间;它的主要缺点是在干燥过程中,组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。

透射电镜样品制备流程因为透射电镜能察看的样品一定很薄（ 60～ 70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单调，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单迅速，能够显示生物大分子、细菌、分别的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、构造、大小以及表面构造的特点。

特别在病毒学中，负染色技术有着宽泛的应用。

样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，可是假如杂质太多，如大批的细胞碎片，培育基残渣，糖类以及各样盐类结晶的存在都会扰乱染色反响和电镜的察看。

特别是不可以有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类简单碳化而有碍察看，所以样品要适合提纯。

②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品聚积影响察看。

操作流程：汲取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，而后用滤纸吸去剩余的液体，滴上负染色液，染色1～2min 后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜察看。

二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜察看供给薄样品的特意技术，是生物学中研究细胞超微构造最常用的技术。

宽泛应用于生物体的各样细胞的超微构造察看。

一般厚度在10～100nm 的切片称为超薄切片，制作这类切片的技术叫做超薄切片技术。

超薄切片制作的过程包含取材、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的白腊切片过程相像。

可是，超薄切片切片过程更加仔细与复杂，要求更严格，并且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。

详细操作步骤、注意事项以下：1．取材和前固定：迅速的切取大小为0.5～1.0mm3 的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入 2.5％戊二醛（入口质量）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。

要求：①取材前必定要和工作人员获得电话联系！②取材选择部位要正确靠谱，保证每块资料都是要察看的部位。

③全部植物样品必定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空 15mins，不可以沉底的样品必定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不可以成块的样品，加戊二醛固定液，离心积淀后送到平台，由平台工作人员办理。

扫描电镜的样品制备3.1 试样制备技术试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。

如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果。

和透射电镜相比，扫描电镜试样制备比较简单。

在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。

扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。

但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件，只简单地引用已有的制样方法是不够的。

扫描电镜的特点是：①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。

②试样应具有良好的导电性能，不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。

③试样表面一般起伏（凹凸）较大。

④观察方式不同，制样方法有明显区别。

⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。

上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件。

在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和照相。

3.1.1 块状试样制备1．导电性材料导电性材料主要是指金属，一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。

这类材料的试样制备最为简单。

只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm，最厚不超过20mm等），然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好），等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。

但在制备试样过程中，还应注意：①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。

②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。