扫描电镜及其制样技术共45页

扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法（一）——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程：从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态，从而得出接近生活状态的样品。

二、实验原理不论动物或植物组织，要求取材时操作必须快速，组织表面要清洁，必要时需超声波清洗，原理同TEM取材，但需强调的是SEM观察表面结构，所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。

取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间，所用的器械要锋利、洁静，避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤，常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。

三、实验器材样品（动物或植物）、双面刀片、培养皿、l.5ml离心管、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、0. 1M PBS缓冲液，乙醇、乙酸异戊酯。

四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确，为了保持生活状态，应在固定前清洗掉表面杂质，即，迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗，也可超声波器中超10s-30s，使样品所带的污物除去（如：气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等）。

2、固定（前固定）经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中，间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。

样品固定的目的：使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。

如果样品没有很好地固定，那么样品在脱水时可能变形，破坏了样品的生活状态，也就是说，固定不好的材料，电镜下不能反映真实结构，所以这一步很重要。

3、冲洗0. 1M PH7.2 PBS缓冲液洗：30分钟中间换3-4次，因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀，所以在后固定之前，用0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后，样品才可能进入锇酸固定液。

4、后固定：1%四氧化锇后固定1-2小时。

5、冲洗：重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次，因四氧化锇与乙醇反应，所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇，样品才能进行脱水。

6、脱水脱水剂为乙醇，室温进行为了减少人工损伤，需要梯度脱水：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，每级15-20分钟，如果是动物样品，脱水时间可5-10分钟，脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止，最后100%乙醇要重复2-3次，保证样品绝对无水。

扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。

透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。

由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。

一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。

2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。

3.导电性能要好，应进行导电处理。

4.二次电子的发射率要高。

5.注意确认和保护样品的观察面。

尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。

(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。

2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。

3.取材部位要准确。

观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。

观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。

为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。

4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。

5.操作应在低温(0～4℃)下进行。

(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

细菌样品前处理取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。

(1)收集菌体:①液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入2.5%戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体,可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。

将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。

(2)固定,脱水按常规方法。

2.5%戊二醛,2~4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4~6h→缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。

(3)临界点干燥: 普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。

将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。

放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。

一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。

(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。

碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。

离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。

细菌样品特殊制备方法；1，固体培养基中的菌体用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌。

然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1%锇酸，盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h以上。

然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进行扫描电镜观察。

2，液体培养基中的菌体取一定的培养液，8000rpm离心3~5min，弃上清液，加入2.5%戊二醛固定2h，pH 7.2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

扫描电镜的样品制备3.1 试样制备技术试样制备技术在电子显微术中占有重要的地位，它直接关系到电子显微图像的观察效果和对图像的正确解释。

如果制备不出适合电镜特定观察条件的试样，即使仪器性能再好也不会得到好的观察效果。

和透射电镜相比，扫描电镜试样制备比较简单。

在保持材料原始形状情况下，直接观察和研究试样表面形貌及其它物理效应（特征），是扫描电镜的一个突出优点。

扫描电镜的有关制样技术是以透射电镜、光学显微镜及电子探针X射线显微分析制样技术为基础发展起来的，有些方面还兼具透射电镜制样技术，所用设备也基本相同。

但因扫描电镜有其本身的特点和观察条件，只简单地引用已有的制样方法是不够的。

扫描电镜的特点是：①观察试样为不同大小的固体（块状、薄膜、颗粒），并可在真空中直接进行观察。

②试样应具有良好的导电性能，不导电的试样，其表面一般需要蒸涂一层金属导电膜。

③试样表面一般起伏（凹凸）较大。

④观察方式不同，制样方法有明显区别。

⑤试样制备与加速电压、电子束流、扫描速度（方式）等观察条件的选择有密切关系。

上述项目中对试样导电性要求是最重要的条件。

在进行扫描电镜观察时，如试样表面不导电或导电性不好，将产生电荷积累和放电，使得入射电子束偏离正常路径，最终造成图像不清晰乃至无法观察和照相。

3.1.1 块状试样制备1．导电性材料导电性材料主要是指金属，一些矿物和半导体材料也具有一定的导电性。

这类材料的试样制备最为简单。

只要使试样大小不得超过仪器规定（如试样直径最大为φ25mm，最厚不超过20mm等），然后用双面胶带粘在载物盘，再用导电银浆连通试样与载物盘（以确保导电良好），等银浆干了（一般用台灯近距离照射10分钟，如果银浆没干透的话，在蒸金抽真空时将会不断挥发出气体，使得抽真空过程变慢）之后就可放到扫描电镜中直接进行观察。

但在制备试样过程中，还应注意：①为减轻仪器污染和保持良好的真空，试样尺寸要尽可能小些。

②切取试样时，要避免因受热引起试样的塑性变形，或在观察面生成氧化层。