奶粉中三聚氰胺含量测定——实验步骤

奶粉中三聚氰胺的高效液相色谱快速测定法作者：吴红萍陶嫣娥来源：《现代商贸工业》2012年第08期摘要：对高效液相色谱法快速测定奶粉中的三聚氰胺进行方法学考察，选用高效液相色谱法，进行线性范围试验、溶液稳定性试验、重复性试验、中间精密度试验。

高效液相色谱法快速测定奶粉中的三聚氰胺，方法线性良好，供试品溶液稳定性好。

不受检验条件、试验环境、人员变化的影响，方法操作简单，准确性好。

关键词：高效液相色谱法；快速测定；三聚氰胺中图分类号：TU文献标识码：A文章编号：1672-3198（2012）08-0187-01自2008年三聚氰胺事件以来，食品安全问题得到了广泛的关注。

“民以食为天”，食物是人类赖以生存的物质基础，食品安全与人类的生命和健康息息相关，在加强和完善食品安全的法律法规以及监督检查力度的同时，作为食品的生产加工销售企业来说，加强对所生产或销售产品的质量控制，保证上市产品的质量尤为重要。

本文对高效液相色谱法快速准确地测定奶粉中残留的三聚氰胺进行方法学考察，意在寻找准确可靠的质量控制方法。

1 试验准备1.1 仪器与试剂Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠为色谱纯，乙醇、三氯乙酸、柠檬酸为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。

1.2 对照品储备液的制备取三聚氰胺对照品约50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加甲醇-水（9∶1）使溶解．并稀释至刻度．摇匀得1ml约含三聚氰胺1mg的溶液作为对照品储备液。

1.3 样品溶液的制备取被测奶粉约2g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入20％乙醇溶液17.5ml，用10%的三氯乙酸溶液定容至刻度．超声处理10min，摇匀，冷却至室温后，以10000转／分的转速离心处理10分钟，经0.22μm的微孔滤膜过滤，即得。

1.4 色谱条件选用岛津COLUMN VP-ODS（150×4.6，5μm）色谱柱，以缓冲液（柠檬酸2.10g，辛烷磺酸钠2.16g，加入约980ml水时溶解，调节pH值至3.0，定容至1000ml）-乙腈（90∶10）为流动相，流速1.0ml／min，柱温40℃，检测波长240nm，进样量20μl。

奶粉中三聚氰胺的测定方法发布时间：2008年9月22日GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺Spectra-Quad实现三聚氰胺含量在线检测超高效液相色谱—电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺反相高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺高效液相色谱法（HPLC）测定饲料中三聚氰胺的含量高效液相色谱-四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量固相萃取与高效液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺液相色谱串联质谱法（LC-MSMS）分析宠物食品中三聚氰胺液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺测定方法本实验中综合各方法稳定性进行比较，主要介绍以下三种：• 固相萃取（SPE）方法*HPLC-UV检测方法•LC-MS检测方法（仅供参考）检测中所需的仪器与条件・Agile ntllOO高效液相色谱仪(美国，Agile nt公司)；二极管阵列检测器(DAD)，检测波长240nm,柱温：40C。

(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6 x 250mm);缓冲液：10mM 柠檬酸,10mM 庚烷磺酸钠；流动相：缓冲溶液：乙腈=85: 15;流速：1.0mL/min。

(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6 x 250mm);流动相：缓冲液：乙腈=85 : 15;缓冲液：10mM 柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0;流速：1.0mL/min ;*离子交换固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰尔科技有限公司)混合型的阳离子交换柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)50支*台式高速(微量)离心机TG16-WS/TG16-W (湖南湘仪离心机仪器有限公司)(1)角转子：12* 1.5ml; 12* 10ml 转速》8000rpm/min，微机控制可定时；常温(2)离心管：10ml.或1.5ml (一套)*三聚氰胺标准品1瓶(250mg, > 99.5%)*三聚氰胺分析方法手册1份其他试剂饲料/奶粉样品；甲醇、乙腈；氨水、乙酸铅、三氯乙酸、柠檬酸、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠(Sigma公司)；甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。

液相色谱-串联质谱法测定奶和奶制品中三聚氰胺残留柳菡1，孙宁宁1，杨雯筌1，刘飞2，丁涛1，徐锦忠 11. 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，南京，210001，2. 赛默飞世尔科技上海有限公司色谱质谱部，上海，201206摘要研究报导了高效液相色谱电喷雾串联质谱联用（HPLC/MS/MS）测定奶和奶制品中三聚氰胺残留的方法。

三氯乙酸溶液沉淀样品中的蛋白，同时提取目标分析物，强阳离子固相萃取柱进一步富集净化后，利用液相色谱-电喷雾串联质谱测定。

方法检测低限为0.05 mg/kg，HPLC/MS/MS添加回收率72 ～ 87 ％之间（基质匹配曲线校正），相对标准偏差（RSD）在4.2％～ 8.2％。

关键词三聚氰胺；奶和奶制品；液相色谱-串联质谱法Determination of melamine residues in milk and dairy products by liquid chromatography tandem mass spectrometryHan Liu1, Fei Liu2, Ningning Sun1, Wenquan Yang1, Tao Ding1, Jinzhong Xu1,1 Animal, Plant and Food Inspection Center (APFIC) of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 2100012 Thermo Fisher Scientific, Shanghai，201206Abstracts: A method for analysis of melamine residues in milk and dairy products was developed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Trichloroacetic acid solutions were used to precipitate proteins and dissociate the target analytes from sample matrix. After matrix purified by strong cation exchange solid phase extraction cartridge, analyses can be performed using HPLC/MS/MS in the selected reaction monitoring (SRM) mode. The limit of dection is 0.05 mg/kg when using HPLC/MS/MS method. The mean recovery was 72 ~ 108％(matrix match calibration curve)and the standard deviation was 4.2 ~ 12.5 % by HPLC/MS/MS method.KEYWORDS:melamine; milk and dairy products; HPLC-MS/MS9月上旬，甘肃等地报告多例婴幼儿泌尿系统结石病例，调查结果表明，导致多名儿童患泌尿系统结石病的主要原因是患儿服用的奶粉中含有三聚氰胺。

高效液相色谱(HPLC-UV)法测定奶粉中三聚氰胺的含量一、实验目的：测量奶粉中三聚氰胺的含量是否达标。

二、仪器：高效液相色谱仪，离心机，固相萃取装置，柱温箱，紫外检测器，C18柱，超声波清洗器，pH 计，电子天平，氮气吹干仪，涡旋混合器；5mL移液管1支,1mL刻度移液管1支，25mL容量瓶1个，100mL容量瓶6个，100mL烧杯1个，微量进样器一支。

三、试剂：三聚氰胺标准品，1%三氯乙酸，氨水，柠檬酸，庚烷磺酸钠（色谱纯），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），二次水，甲醇水溶液（准确量取50mL甲醇和50mL水，混合备用），5%氨化甲醇（量取5mL氨水和95mL甲醇混合备用），离子对缓冲溶液（准确称取2.10g柠檬酸和2.02g 庚烷磺酸钠加水溶解后调节pH=3，定容至1L备用），三聚氰胺储备液（准确称取100mg三聚氰胺，在100mL容量瓶中用甲醇水溶液定容），净化柱（固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯），氮气。

四、实验步骤：1.样品预处理：准确称取2g样品，用10mL 1%三氯乙酸溶解后转移至25ml容量瓶中，乙腈定容。

超声提取10分钟后离心，干过滤。

用5mL移液管准确移取5mL过滤后的溶液过净化柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤并抽干后后用约6mL 5%氨化甲醇洗脱。

洗脱液用氮气吹干后用1mL流动相定容，涡旋混合1分钟后经0.20 μm有机相滤膜过滤后进样。

2.色谱条件：C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以离子对缓冲溶液+乙腈（85+15）作为流动相，流量为1.0 ml/min，柱温为35 ℃，检测波长为240 nm，进样量为20 μl。

3. 标准曲线的绘制：将三聚氰胺标准储备液（1.00×10^3 mg/L）用甲醇-水溶液（1+1）逐级稀释得到浓度为1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L的标准系列溶液，以峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线。

2010级化学教育仪器化学综合性与设计性实验—高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量——2012-06-03一、实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法）二、摘要、关键词：[摘要]三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。

它是白色单斜晶体,为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取,离心, 结合高效液相色谱进行样品测定。

A液：0.9508 g辛烷磺酸钠（5mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。

色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5 µm）,检测波长：240nm。

[关键词] 高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品三、引言1、对三聚氰胺的概述：三聚氰胺(Melamine) (化学式:C3H6N6 ) ,俗称密胺、蛋白精,国际纯粹与应用化学联合会命名为「1 ,3 ,5 - 三嗪- 2 ,4 ,6 - 三氨基」,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。

它是白色单斜晶体,几乎无味,微溶于水(311g/PL常温) ,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等,对身体有害,不可用于食品加工或食品添加物。

三聚氰胺的结构式如下：三聚氰胺最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF) 的原料。

三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。

该树脂硬度比脲醛树脂高, 不易燃,耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀,有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度,广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。

蛋白质主要由氨基酸组成。

蛋白质平均含氮量为16 %左右,而三聚氰胺的含氮量为66 %左右。

通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过检测含氮量来估算蛋白质含量,因此,添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高,从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。

奶粉中三聚氰胺的测定Determination of melamine in milk powder1 原理三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。

本方法采用20%甲醇溶解样品，5%三氯乙酸沉淀蛋白，提取样品中的三聚氰胺，经液相色谱仪C18柱分离，检测波长235nm条件下进行检测。

2 试剂使用优级纯、色谱纯试剂，色谱用水符合GB/T6682一级水的规定。

2.1 20%甲醇溶液：甲醇+水(2+8)2.2 5%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸5g溶解于100mL水中。

2.3 乙腈2.4 混合液：称取2.10g一水合柠檬酸和1.88 g己烷磺酸钠，溶于水中，稀释至1000mL 混匀。

2.5 流动相：混合液（2.4）+乙腈（2.3）=92+8。

2.6 标准储备液配制：准确称取三聚氰胺标准品0.1000g，用20%甲醇溶液（2.1）定容至100mL。

三聚氰胺含量为1.00mg/ mL，于4℃冰箱内避光保存。

2.7三聚氰胺标准系列的配制：准确吸取标准储备液(2.6)0.100mL；1.00mL；2.50mL；5.00mL；10.00mL至100mL容量瓶中，并用20%甲醇溶液（2.1）定容至刻度。

配制成三聚氰胺浓度分别为1.00mg/L；10.0mg/L；25.0mg/L；50.0mg/L；100mg/L的标准系列。

3仪器和设备3.1 液相色谱仪：附二级管阵列检测器（DAD）或紫外检测器（UV）3.2 超声波清洗器3.3 超速离心机3.4 涡旋混合器3.5 滤膜：0.45μm4 分析步骤4.1 试样处理：将奶粉样品混匀，准确称取样品1～5g于50mL比色管中，加入20%甲醇溶液（2.1）约35mL ，震荡混匀，超声提取5min ，加入5%三氯乙酸(2.2)5mL ，并用20%甲醇溶液(2.1)定容至刻度，摇匀。

以3000rpm/min 超速离心5min 。

高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺的含量姓名：班级：学号：摘要：三聚氰胺是一种低毒的化工原料，动物实验结果表明，其在动物体内代谢很快且不会存留，主要影响泌尿系统。

乳制品中添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试，就送检的奶粉样品，采用高效液相色谱法（HPLC）测定其中的三聚氰胺的含量。

关键词：三聚氰胺食品质量与安全奶粉标准依据高效液相色谱检测方法1材料与方法1.1盐酸（HCl）。

1.2盐酸苯肼（C6H8N2•HCl）。

1.3铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）。

1.4硫酸（H2SO4）。

1.5氢氧化钠（NaOH）。

1.6盐酸（HCl）（10+2）：量取100mL盐酸，加入20mL水中，混匀。

1.7盐酸（HCl）（1+1）：量取50mL盐酸，加入50mL水中，混匀。

1.7盐酸苯肼溶液（C6H8N2•HCl）（10g/L）：称取1.0g盐酸苯肼，加80mL水溶解，再加2mL盐酸（10+2），加水稀释至100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。

1.8铁氰化钾溶液（K3[Fe（CN）6]）（20g/L）：称取2.0g铁氰化钾，加水溶解并稀释至100mL。

1.9硫酸（H2SO4）（1+35）：量取1mL硫酸缓慢注入35mL水中，混匀。

1.10碘标准溶液（I2）（0.1mol/L）：配制和标定按照GB/T601或购商品化标准物质。

1.11硫代硫酸钠标准滴定溶液（Na2S2O3）（0.1moL／L）：配制和标定按照GB/T601或购商品化标准物质。

1.12氢氧化钠溶液（NaOH）（40g/L）：称取4g氢氧化钠，加水溶解并定容至100mL。

1.13甲醛标准储备液（CH2O）原理：以三聚氰胺为原料制作的成型品经4%乙酸浸泡，浸泡液中三聚氰胺用高效液相色谱分离、测定，以保留时间定性、峰高或峰面积定量。

1.14 奶粉1.1 主要材料与试剂1.1.1盐酸（HCl）。

1.1.2盐酸苯肼（C6H8N2•HCl）。

摘要本文研究了九个合格奶粉样品，并配制了掺入不同含量三聚氰胺的奶粉样品，利用Nicolect 380型傅立叶变换红外光谱仪探讨检测奶粉中三聚氰胺的可行性，探讨了不同的制样方法对红外光谱测定结果的影响。

通过对三聚氰胺红外光谱特征峰的分析，确定了检测奶粉中三聚氰胺的定性分析方法。

将三聚氰胺的NH2伸缩振动峰3469cm-1、3419cm-1作为判断奶粉是否含有三聚氰胺的主要依据。

当三聚氰胺含量很低时（约400g kg-1），选用糊化方法制样，运用仪器数据处理软件OMNIC二阶导数可以实现对奶粉中三聚氰胺的定性鉴别，该方法可作为对高效液相色谱法的补充，为奶粉中掺入三聚氰胺定量检测提供依据，可大大提高检测效率，实现现场快速检测。

关键词：奶粉；三聚氰胺；傅里叶变换红外光谱AbstractIn this article, nine qualified Milk powder were detected, preparing the milk powder samples, which were added different contents of melamine. Using Nicolect 380 Fourier Transform Infrared Spectroscopy to explore the feasibility of detection of melamine in milk powder. Determining the qualitative analysis method of the detection of the melamine in the milk power, by analyzing the infrared absorption peak of melamine.The NH2 stretching vibration of melamine is in the 3469cm-1 and 3419cm-1,which are the basis of determining the melamine in the milk powder.When the melamine content is low (about 400g/kg-1),using gelatinization to prepare samples. Using the second derivative of the Instrument data processing software OMNIC can qualitatively identify the melamine in milk powder, as the supplement of high performance liquid chromatography. And this method can provide the basis for quantitative detection of melamine in milk powder. This method can greatly improve the efficiency of detection,achieving rapid detection of the scene.Key words: milk; melamine; fourier transform infrared spectroscopy目录摘要 (I)Abstract (II)第1章绪论 (1)1．1 奶粉 (1)1.1.1 蛋白质对人体的作用 (1)1.1.2 奶粉的成分 (2)1.1.3 奶粉的分类 (3)1.1.4 奶粉的检测方法 (4)1.1.5 奶粉的红外光谱分析 (4)1.1.6 有毒奶粉出现 (5)1.2 三聚氰胺 (6)1.2.1 三聚氰胺的结构 (6)1.2.2 三聚氰胺的性质 (6)1.2.3 三聚氰胺的用途 (7)1.2.4 三聚氰胺的危害 (7)1.3 傅立叶变换红外光谱法 (7)1.3.1 红外光谱简介 (7)1.3.2 红外光谱仪分类 (8)1.3.3 红外光谱的应用 (8)1.4 紫外可见分光光度法 (9)1.4.1 紫外可见分光光度法简介 (9)1.4.2 紫外可见分光光度法的应用 (9)1.5 本文研究的内容 (10)第2章实验部分 (11)2.1 实验仪器设备与试剂药品 (11)2.1.1 实验仪器设备 (11)2.1.2 实验试剂药品 (11)2.2 实验操作 (12)2.2.1 样品来源 (12)2.2.2 红外光谱定性 (12)2.2.3 紫外光谱定量 (13)第3章结果与讨论 (14)3.1 三聚氰胺和奶粉的红外谱图分析 (14)3.2 制样方法比较 (16)3.3 9号奶粉各种比例组合图 (20)3.4 9号奶粉低含量含三聚氰胺导数组合图 (22)3.5 各样品含三聚氰胺组合图 (23)3.6 低含量各样品导数组合图 (24)3.7 定量测定 (26)结论 (28)参考文献 (29)致谢 (31)第1章绪论早在1878年, 恩格斯就说过“生命是蛋白质的存在方式”。