非小细胞肺癌组织蛋白酶Ｄ表达分析
[摘要]目的：探讨非小细胞肺癌(nonsmaU-ceil lung cancer，NSCLC)组织蛋白酶D(cathepsin D,Cath-D)表达与NSCLC发生、发展及浸润转移的关系。
方法：肺癌组56例肿瘤组织保存蜡块，其中临床分期I期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期13例。
病理分级高分化16例，中分化22例，低分化18例。
另选择18例癌旁组织作对照。
采用免疫组织化学染色法和原位杂交法检测Cath-D表达和mRNA水平。
结果：NSCLC组Cath-D定位于癌细胞胞浆，阳性率(41/56，73.2％)显著高于癌旁组(2/18，11.1％)，淋巴转移NSCIC中的阳性率显著高于无转移NSCLC的，不同临床分期、不同病理分化程度的NSCLC Cath-D蛋白阳性表达率有显著区别。
Cath-D mRNA阳性率(39/56，69.6％)显著高于癌旁组(1/18，5.6％)，不同临床分期、不同病理分化程度的NSCLC Cath-D mRNA阳性表达率有显著区别。
结论：NSCLC组织中Cath-D和mRNA均有较高水平表达，Cath-D表达与NSCLC 的发生、发展及浸润转移有关。
[关键词]非小细胞肺癌；组织蛋白酶-D；免疫组织化学；原位杂交
肿瘤转移是恶性肿瘤患者晚期表现及患者死亡的主要原-因，近年来发现，组织蛋白酶-D(Cathepsin D，Cath-D)在恶性肿瘤侵袭和转移中起重要作用，Cath-D 是一种溶酶体酸性蛋白酶，具有刺激肿瘤细胞生长、溶解细胞基底膜及细胞外基质和结缔组织的能力。
本研究应用免疫组织化学染色技术和原位杂交技术检测56例非小细胞肺癌(nonsmall ceil lung cancer，NSCLC)组织中Cath-D的表达，探讨Cath-D表达在NSCLC发生、发展和预后的作用。
1 资料与方法
1．1 一般资料：56例病理标本取自2000年1月～2005年12月在本院胸外科手术的NSCLC患者的保存蜡块，其中男30例，女26例，年龄45～69岁，平均(57.5±6.3)岁，经病理检查证实为NSCLC。
56例标本中鳞癌22例、腺癌20例、腺鳞癌8例、大细胞癌6例。
高分化癌16例、中分化癌22例、低分化癌18例，临床分期I期15例、Ⅱ期28例、Ⅲ期13例，有淋巴结转移25例，无远处淋巴结转移31例。
对照癌旁组18例标本选用离肿块5cm的肺组织。
1．2 免疫组织化学染色：以上病理标本均经10％福尔马林固定，石蜡包埋5 p,m切片。
兔抗人Cath-D多克隆抗体购自SantaCruz公司，工作浓度为1:200，SP试剂盒及DAB显色剂为北京中山生物公司产品，具体步骤按说明书进行，抗
原修复方法为柠檬酸缓冲液(pH 6.0)95℃加热作用30min，0.01M PBS代替一抗作阴性对照。
结果判定：随机选择5个高倍视野进行观察，平均阳性细胞数≥10％为阳性片。
1．3 原位杂交：石蜡切片常规脱蜡，3％H2O2：室温处理10min，新鲜配制的胃蛋白酶室温下消化5min。
含DEPC的PBS缓冲液洗涤5min×3次。
1％PFA/0.1M PBS(含DEPC水)室温处理10min。
预杂交液37℃孵育3h。
杂交液37℃孵育20h。
2×SSC缓冲液洗涤5min×2次。
封闭液37℃条件下作用30min。
生物素化鼠抗地高辛工作液37℃孵育60min。
PBS缓冲液(含DEPC)洗涤5min×3次。
SABC37℃孵育30min。
PBS缓冲液(含DEPC)洗涤5min×3次。
生物素化过氧化物酶37℃作用20min，PBS洗涤5mi-n×3次。
DAB显色。
显微镜下观察，适时终止反应。
梯度酒精脱水。
二甲苯透明，中性树胶封片。
结果判定：随机选择5个高倍视野进行观察，平均阳性细胞数；≥10％为阳性片。
1．4 统计分析：所得数据以例数或％表示，采用SPSS10.0统计学软件进行)x2分析，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2．1 NSCLC中Cath-D免疫组化检测结果：Cath-D阳性为细胞胞浆出现棕黄色颗粒。
NSCLC中Cath-D阳性表达率为73.2％(41/56)，癌旁组织为11.1％(2/18)，差异有非常显著性。
NSCLC中不同病理类型Cath-D表达无显著区别，NSCLC不同临床分期Cath-D阳性表达率差异有显著性。
随着肿瘤分化程度由高至低，Cath-D阳性表达明显增强，差异有显著性。
有淋巴结转移的NSCLC中Cath-D表达明显高于无转移组。
见表1。
2．2 NSCLC中Cath-D mRNA检测结果：Cath-D mRNA阳性为细胞胞浆中出现棕黄色颗粒。
肺癌组织中Cath-D mRNA阳性表达率为69.6％(39/56)，癌旁组织为5.6％(1/18)。
差异有显著性。
NSCLC不同临床分期及病理分级Cath-D mRNA阳性率有显著性区别，有淋巴结转移的NSCLC中Cath-D mRNA阳性率显著高于无转移NSCLC。
见表1。
3 讨论
肿瘤转移是一个十分复杂的、涉及多个环节的、多步骤的连续过程，它受多个基因的调控，包括肿瘤转移相关基因、蛋白溶解酶、自分泌生长因子、粘附分子等。
肺癌象其它肿瘤一样，其浸润转移极其复杂。
肿瘤浸润转移过程中肿瘤细胞与周围的细胞外基质之间发生一系列动态变化，这一过程中有许多生物酶的释放，可使细胞外基质成分降解，进而促进肿瘤细胞的浸润转移。
组织蛋白酶(cathepsin)是一类主要存在于溶酶体的胞内蛋白酶，它属于半胱氨酸蛋白酶家族，其亚型有B、C、H、K、L、M、N和S等，目前研究最多的是B、D和L型。
Cath-D能促进细胞增殖，而且既能直接消化细胞外基质和基底膜，还可作为其他组织蛋白酶的生理性调节剂，激活组织蛋白酶B，继而依次激活尿激酶型纤溶酶原激活剂，使其转变为纤溶酶，组织蛋白酶B和纤溶酶均参与细胞外间质水解，从而促进肿瘤侵袭转移，因而Cath-D在肿瘤转移过程中起着重要作用。
有研究表明，乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤Cath-D表达水平与肿瘤分化程度、转移和预后密切相关。
本研究免疫组化结果显示Cath-D在癌旁组织细胞中阳性表达率较低，而在NSCLC中阳性表达率为73.2％(41/56)。
在NSCLC中，Cath-D的阳性表达率在不同临床分期中有显著性区别，伴有淋巴结转移的明显高于无转移的，说明Cath-D表达与NSCLC浸润转移相关。
随着临床分期的增加，Cath-D阳性表达强度随之而增强，表明Cath-D表达与NSCLC预后有关。
高表达的Cath-D通过内吞作用可以降解细胞外基质，释放血管生成因子，如碱性纤维母细胞生长因子，它能刺激新生血管形成，导致肿瘤生长和转移。
原位杂交结果与免疫组化结果有一致性，从基因转录水平上说明同样的结论。
以上研究从蛋白水平和转录水平提示，Cath-D可作为判定NSCLC恶性程度、浸润转移及预后的一个生物学指标，是肺癌有价值的肿瘤标记物，也可能是NSCLC治疗潜在的新靶点。
