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高温曲中产酱香细菌的分离和筛选试验1.产酱香细菌的分离1.1采样：曲样放入无菌袋密闭及时送实验室，用无菌小刀切开曲块，将大曲外中内层混合均匀，粉碎后备用。
1.2平板分离培养基：分离培养基：营养琼脂（g/l）或葡萄糖蛋白胨培养基：牛肉膏5 蛋白胨10 氯化钠5 琼脂15-20 或蛋白胨5 葡萄糖5 K2HPO54高盐培养基：牛肉膏5 蛋白胨10 氯化钠60 琼脂15-20 PH均为7.2-7.4 斜面培养基：牛肉膏5 蛋白胨10 氯化钠5 琼脂15-205种子培养基：酵母膏5 蛋白胨10 氯化钠10或蛋白胨5 葡萄糖5 K2HPO4筛选培养基：麸皮99g 葡萄糖1g 加水70ml 高压灭菌30min或麦粒培养基：小麦粉碎成麦粒麦粉各半，加水1:1.0-1.2 润浸18h，经蒸熟冷却打散，称取30-50g/250ml三角瓶，高压灭菌45min。
1.3产酱香菌分离：高温培养法热处理培养法高盐培养法1.3.1高温培养法：取1.0g曲粉加入99ml/250ml生理盐水，150r/min 30min，适当稀释，取三个梯度涂布于营养琼脂培养基 45-50℃培养24h.1.3.2热处理培养法：1.0g曲粉加入50ml/250ml种子培养基中，37℃ 150r/min 富集培养24h，80-85热处理20min，适当稀释，取三个梯度涂布于营养琼脂培养基37℃培养24h.1.3.3高盐培养法：取1.0g曲粉加入99ml/250ml生理盐水，150r/min 30min，适当稀释，取三个梯度涂布于营养琼脂培养基37℃培养24h.分离结果与讨论：高温培养法：花瓣状光滑状毛绒状三种热处理培养法：花瓣状毛绒状两种高盐培养法：光滑状毛茸状乳头状水滴状高温法热处理法高盐法菌落总数：x106 50 1 4高温法耐受高温细菌和高温处于休眠的芽孢，高盐法除芽孢菌外，还有一些耐高盐的微生物。
制曲过程中，随制曲温度的升高，水分蒸发，微生物处于高渗高盐状态，部分耐盐微生物生长良好。
大曲中有哪些主要微生物？高温曲和中温曲的主要微生物有什
么差别？
不同的制曲原料，工艺条件(主要是温度)，决定大曲中主要微生物的品种和数量。
通常中温大曲的上霉温度不超过40℃，热曲温度不超过50℃，其上霉微生物主要是拟内孢霉的“白色粉末”，根霉的絮状菌丝，酵母的乳白或乳黄色的蜡脂质小点；曲心微生物主要是拟内孢霉、根霉、曲霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、酵母菌类和细菌类。
以汾酒大曲为例，其主要微生物有根霉、拟内孢霉、犁头霉、毛霉、黄曲霉、黑曲霉、红曲霉、酵母菌、汉逊酵母、假丝酵母、毕赤酵母、芽裂酵母．乳酸菌、醋酸菌、产气杆菌、芽孢杆菌、假单孢杆菌、小球菌等。
构成汾酒典型清香的乙酸乙酯、乳酸乙酯、琥珀酸乙酯的芳香和口味成份的主要微生物，是根霉、拟内孢霉、红曲霉、酵母菌、汉逊酵母和乳酸菌，其中汉逊酵母是产生乙酸乙酯的杰出代表。
高温大曲靠堆曲升温，制曲升温可高达60℃以上。
在曲块培养过程中，一些中温性的微生物不能适应这样的温度，而能适应这种温度的是耐高温的微生物。
以茅台酒大曲为例，多数微生物是些黄色霉菌、高温细菌，其中主要是芽孢杆菌、乳酸菌和醋酸菌类，酵母菌．汉逊酵母极少或很难发现。
茅台酒大曲中，由于培养温度由低到高，多种微生物兴衰交替，最终表现为曲霉、青霉、拟青霉、红曲霉、芽孢杆菌、乳酸菌、醋酸菌等，其中以芽孢杆菌的数量最多。
肖尔布拉克高温大曲中细菌分离及产香研究杨佳;祖拜代;杨青;丁雪梅;赵树欣;黎贤书;杨奕【摘要】39 strains of bacteria were isolated from Xiaoerbulake Jiangxiang high-tem perature Daqu by normal temperature treatment and heat treatment. Fermented in wheat-extract medium, 15 of these strains produced obvious Jiangxiang flavor. The 15 strains went through fermentation process again and their protease activity were determined.All 15 strains had protease activity, and 6 of them (C1-3, C4, C8, R12, R19 and R20) had relatively high protease activity. Through 16S rDNA sequence analysis, strains C1-3, C4, R19, and R20 were identified as Bacillus subtilis,C8 as Bacillus methylotrophicus, and R12 as Kocuria sp. Then the fermentation liquid of the 6 strains went through GC-MS analysis. The results showed that the numbers of components generated were 8, 19, 24, 15, 8 and 9, respectively, and that strains C1-3 and R19 generated more Tetramethylpyrazine than other strains.%从肖尔布拉克酒业酱香型高温大曲中通过常温法和热处理法分离出了39株细菌，采用麸皮浸出汁培养基发酵，发现其中15株细菌的发酵液酱香味明显。
高温大曲中微生物的分离与鉴定刘效毅;郭坤亮;辛玉华【摘要】The diversity of microbes in high-temperature Maotai-flavor Daqu was analyzed by traditional separation and culture method and modern molecular biological method.147 microbial strains were separated successfully,among them,97 strains were bacteria includingBacillus,Actinomycetes,Staphylococcus,and Micrococcus,and the other 50 strains were mould including Penicillium,Aspergillusfumigatus,Mucor,Alternaria,Phoma,Chaetomium globosum,Eurotium,and Monascus.The research results further proved the diversity of microbes in high-temperature Daqu.（Tran.by YUE Yang）%采用传统分离培养方法和现代分子生物学方法,对酱香型白酒高温大曲中微生物的多样性进行研究分析。
从酱香型白酒高温大曲中分离出147株微生物,其中97株为细菌,包括芽孢杆菌、放线菌、葡萄球菌、微球菌4类;50株霉菌,包括青霉、曲霉、毛霉、交链孢霉、茎点霉菌、球毛壳、散囊菌、红曲霉8类,研究结果表明,高温大曲中的微生物具有高度的多样性。
【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】4页(P52-55)【关键词】酒曲;微生物;鉴定;生理生化特性;16S;rRNA基因;ITS【作者】刘效毅;郭坤亮;辛玉华【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;中国科学研究院微生物所,北京100101【正文语种】中文【中图分类】Q93-3;TS261.1茅台酒是高温大曲酱香型白酒的典型代表，以用曲量大，制曲温度高为特点。
“曲是酒之骨”，酒曲的好坏直接影响着酒的产量和质量。
研究发现，高温曲是一种高温细菌酒曲[1]，其发酵温度可高达65℃[2]，酒曲中以芽孢杆菌最多，霉菌含量很少，基本上无酵母菌[3]。
这些微生物在育种、酿酒、酶制剂、乳酸生产等方面具有重要作用，因此研究酒曲中的微生物具有重要意义。
本研究利用传统的分离培养方法和分子生物学方法相结合，对高温大曲中的微生物进行了分离鉴定。
1 材料与方法1.1 材料菌种来源：传统酱香型白酒高温大曲，具体试验样品见表1。
培养基：细菌采用PYG培养基；霉菌采用PDA培养基。
1.2 实验方法1.2.1 菌株的分离??? ??? ??? ????????????? ?????? ?????? ?????? ????????? ????? ????? ????? ?? ????? ????? ????? ?? ?????采用倍比稀释法对酒曲中的微生物进行分离培养。
细菌分别在37℃和42℃下培养1～3 d，计数；霉菌分别在28℃和42℃下培养5～7 d，计数。
1.2.2 DNA的提取和扩增采用细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒（博大泰克公司）提取细菌DNA；采用植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）提取霉菌DNA。
采用细菌16S rRNA基因序列通用引物27F和1492R扩增细菌16S rRNA基因序列；采用真菌ITS序列通用引物ITS4和ITS5扩增霉菌ITS序列。
1.2.3 芽孢杆菌gyrB基因的扩增扩增引物：UP-1：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG)T T(TC)GA-3'；UP-2r：5'-AGCAGGGTACGGAT-GTGCGAGCC(AG)TC(TCAG)AC(AG)TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAT-3'。
测序引物：UP-1S：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3'；UP-2Sr：5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3'。
PCR扩增条件：95℃使DNA预变性5 min；然后进入30个循环：95℃使DNA变性1 min，52℃引物退火1 min，72℃延伸1.5 min；最后72℃延伸5 min。
1.2.4 序列分析将获得的基因序列导入美国NCBI网站的Blastn在线软件，选择 Nucleotide Collection(nr/nt)数据库，运行Blastn程序，获取基因序列同源性最高的菌群。
1.2.5 鉴定方法细菌的鉴定根据16S rRNA基因序列比对结果并结合文献[4-6]的方法进行；霉菌的鉴定根据ITS序列比对结果并结合文献[7-9]的方法进行。
2 结果与分析2.1 平板培养计数按实验设计在不同温度条件下进行培养，考察不同曲中的微生物结构，结果见表2。
从表2可以看出，细菌在酒曲中的数量较大，并且不同温度下数量变化不大；而霉菌在不同的温度下数量变化较大；不同酒曲之间微生物总量变化不大，而细菌、霉菌间变化明显,其中黑曲与其他酒曲间细菌的数量变化最明显；白曲与其他酒曲间霉菌的数量变化最明显。
2.2 细菌16S rRNA基因序列和真菌ITS序列比对经BLAST比对后发现细菌主要为芽孢杆菌、放线菌、葡萄球菌和微球菌，其中芽孢杆菌占绝大部分；霉菌主要为青霉、曲霉、毛霉、球毛壳、交链孢霉、散囊菌和茎点霉菌。
2.3 芽孢杆菌gyrB基因的鉴定结果及典型芽孢杆菌菌株生理生化鉴定87株芽孢杆菌经gyrB基因鉴定后，确定的芽孢杆菌共有7个种，其中解淀粉芽孢杆菌47株，坚强芽孢杆菌5株，枯草芽孢杆菌7株，地衣芽孢杆菌17株，巨大芽孢杆菌7株，Bacillus sonorensis 3株，Bacillus flexus 1株。
菌株生理生化实验结果见表3。
? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?????? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?????? ?? ?? ?? ?? ? ! " " #$%&’ "? ??()$%*+? ?? "? ?? "? ?? ?? ??,-./$? ?? ?? ?? ?? ?? ?? "012./$? "? "? ?? "? ?? ?? ??3"4./$? ?? "? ??"? ?? ?? ??567/$? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ??8./$? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ??9:;<? ?? ?? ?? ?? =?>@A? "? B?CD?E@A?"? ?? ????????????????????????????将菌株特征与《伯杰氏系统细菌学手册》中的标准菌株对照，并结合16S rRNA 基因和gyrB基因的比对结果，鉴定出菌株HQX1.1为解淀粉芽孢杆菌；菌株HQX1.19为坚强芽孢杆菌；菌株BQX2.10为地衣芽孢杆菌；菌株BQX2.11为枯草芽孢杆菌；菌株CQX4.8为Bacillus sonorensis；菌株 LHQX1.1 为 Bacillusflexus；菌株 HQX3.6为巨大芽孢杆菌。
2.4 放线菌类的鉴定与菌株LBQX2.10 16S rRNA基因序列同源性99%以上的放线菌为Actinobacterium、Streptomyces tendae、Streptomyces violaceorubidus、Streptomyces collinus、Streptomyces lienomycini、Streptomyces qlobisporus、Streptomyces tritolerans和 Streptomyces frandiae；与菌株LBQX2.9、LHQX3.1和LHQX3.1 16S rRNA基因序列同源性99%以上的放线菌为Saccharopolyspora hordei和Saccharopolyspora hirsuta；表4为其鉴定结果，表5为生理生化特征结果。
将菌株特征与《放线菌的分类和鉴定》中的标准菌株对照，并结合16S rRNA基因的比对结果，鉴定出菌株LBQX2.9、LHQ3.1和 LHQX3.2为Saccharopolyspora hirsuta；菌株 LBQX2.10 为 Streptomyces fradiae。
2.5 其他属细菌的鉴定与菌株 BQX2.3、BQX2.18、CXQ4.13 和 CXQ4.14 的16S rRNA基因序列同源性在99%以上的细菌为葡萄球菌、腐生葡萄球菌和表皮葡萄球菌；与菌株LHQX1.9和LCQX4.1 16S rRNA基因序列同源性在99%以上的细菌为微球菌、藤黄微球菌、和土微球菌。
表6为其生理生化鉴定结果。
将菌株特征与《伯杰氏系统细菌学手册》中的标准菌株对照，并结合16S rRNA 基因序列的比对结果，鉴定出菌株 BQX2.3、BQX2.18和 CQX4.14为腐生葡萄球菌；菌株CQX4.14为表皮葡萄球菌；菌株LHQX1.9和LCQX4.1为藤黄微球菌。
2.6 霉菌的鉴定根据ITS序列鉴定结果及其形态特征鉴定了20株典型的菌株，其鉴定结果如下：与菌株HQM1.1 ITS基因序列同源性达100%的菌株为Alternaria。
该菌菌丝生长较慢，菌落形状不规则，有匍匐菌丝，菌丝中间有横隔，孢子较小，为倒棒状，顶端延长成喙状，淡褐色，呈有分支的链状排列，鉴定其为交链孢霉。
与菌株HQM1.2 ITS基因序列同源性达100%的菌株为Phoma。
该菌菌丝生长较慢，菌落较小，生长初期为白色，后期为灰白色，菌落反面为红色，有分生孢子器，孢子较小，为棒状，链状排列，鉴定其为茎点霉菌。
与菌株 HQM1.3、BQM2.4、HQM3.6 和 CQM4.3 ITS基因序列同源性达100%的菌株为Chaetomium globosum。
这4株菌菌丝生长较慢，有气生菌丝，菌落有灰色的边缘，边缘从灰色变为黑色。
菌丝中间有隔，有球形的子囊壳，鉴定其为球毛壳。
与菌株HQM1.4 ITS基因序列同源性达99%以上的菌株为Monascus，该菌菌落质地为絮状，厚度中等，有辐射状沟纹，表面初期为白色，后期呈现淡红色，菌落反面开始为黄色，后期变为红褐色。
