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基因工程制药技术 ppt课件

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基因工程药物 ppt课件

基因工程药物 ppt课件
基因工程药物 （工程菌）
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1
基因工程药物
• 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质， 然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操 作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体 细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在 受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病 的蛋白质，即基因疫苗或药物。
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2
工程菌
• 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一 般称为“工程菌”。
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3
目录
六6 采取的措施
五5 基因工程药物的安全性及质量 检控
四4 基因工程药物的技术路线
三3 基因工程药物的特点
二2 利用微生物生产药物的优越性
一1 基因工程药物的种类
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4
一、基因工程药物的种类
• 用于基因治疗的基因工程药物除了能杀死不正常细胞外可能同时伤害正 常的细胞。
• 当用于生产基因工程药物的重组体发生突变或对目的产品进行修饰、纯 化时，都有可能产生或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而 生物活性迥异的变异体。
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17
六、采取的措施
• 构建基因工程药物表达载体时给目的基因组装诱导型启动子，使 其在诱导条件下才能有效表达。
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19
• 目前对基因工程操作的后果还存在一定程度的不可预测性和不可控制性， 转基因生物有可能隐藏某些危害性。
• 基因工程药物与一般药品不同，它来源于活的生物体，在发酵、细胞培 养、产品分离纯化等生产过程有其固有的易变性，导致基因工程药物质 量的不稳定性。
• 在制备的基因工程药物中残留的抗生素有可能使病人产生对抗生素的抗 药性。

基因工程制药(多图版)

基因工程制药(多图版)
第一步：了解基因的本质
2019/11/16
医药交流精品课件
1Байду номын сангаас
2019/11/16
医药交流精品课件
2
四种碱基互补配对原则
2019/11/16
生命的信息全部存储在DNA列里。
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3
发现者沃森和克里克获得了 诺贝尔奖。
2019/11/16
医药交流精品课件
真正的背后英雄 不应被遗忘，她 是富兰克林。
4
2019/11/16
医药交流精品课件
感 受 造 化 的 神 奇
5
第二步：了解基因工程制药的基本过程
2019/11/16
医药交流精品课件
6
2019/11/16
放大培养
摇瓶培养
医药交流精品课件
7
倒入离心管 或离心瓶
2019/11/16
放入离心机 医药交流精品课件
离心效果 8
细胞破碎
超声破碎
2019/11/16
高压匀浆破碎
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胀破
9
分离纯化
盐析
亲和色谱
2019/11/16
透析
医药交流精品课件
凝胶色谱 10
分离纯化
电泳槽加样
2019/11/16
电泳
电泳结果
医药交流精品课件 凝胶电泳分离
11
第三步：熟悉部分相关过程实体设备 和操作对象
2019/11/16
医药交流精品课件
12
分离纯化实体设备
色谱分离设备
2019/11/16
医药交流精品课件
13
透析设备
2019/11/16
磁力搅拌器

基因工程制药

基因工程制药

PCR扩增目的基因片段用Taq DNA聚合酶
33
限制性核酸内切酶：识别特异序列，切割DNA
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特 定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制 酶有200多种。
34
4.2、限制性核酸内切酶酶切DNA的方法 ※ 单酶切法: 用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品。若DNA样品 是环状DNA分子,完全酶切后,产生与识别序列数(n)相 同的DNA片段数, 并且DNA片段的两末端相同。
简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能 性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码
子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。
核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号 外还出现如R、Y、M、K等其它字母
引物酶切位点的确定
目的基因片段 内切酶需要的最低保护碱基的数目
26
1.3.2 紫外光分光光度计法
※ DNA或RNA分子，蛋白质和多糖类分别在紫外光260nm，
280nm和230nm处有特异吸收峰。吸收强度（OD）与系统 中各分子浓度成正比。 ※ DNA或RNA的含量 双链DNA浓度（ug/ml）＝50 OD260 稀释倍数 单链RNA浓度（ug/ml）＝40 OD260 稀释倍数 ※ DNA或RNA的质量的判断标准
※ 双酶切法:
用两种不同的限制性内切核酸酶酶切同一种 DNA分子
的方法。DNA分子无论是环状 DNA分子, 还是线形
DNA片段, 酶切结果，DNA片段的两个粘性末端是不 同的( 用同尾酶酶切除外)
35
限制性核酸内切酶反应事项:
1 、反应系统除酶本身外 , 还应包括反应底物、反应缓冲液 （双酶切最好选用同意缓冲溶液)和合适的反应温度。

《基因工程制药》课件

《基因工程制药》课件
、改变细胞特性等。
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛

第三章 基因工程制药技术

第三章 基因工程制药技术

美国基因制药状况
药品名 原适应症 2000年新适应症 Actimmune 类风湿（1990） 恶性骨刺 Ambisone 细菌感染（1997） HIV感染 Apligraf 腿溃疡(1998) 糖尿病足 Enbrel 风湿病(1998) 类风湿关节炎 Helixate 血友病A(1994) 第二代VIII因子（血友病） KogenateES 血友病A(1989) 第二代VII因子（血友病） Novantrone 白血病(1996) 前列腺癌 Gonal-F 妇科感染(1998) 不育症 Renagel Capsules 肾透析(1998) 血透析 Tamiflu 流感初期(1998) 急性流感 Tripedia 百白破预防(1996) 4-6岁预防百白破
DNA合成仪细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 克隆载体* （1）从基因组 DNA获取目 的基因基因组DNA
存在于转化细胞内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合
重组DNA分子 受体菌
• 起步较晚，基础较差。α 1b 型基因工程 干扰素是由我国自行研制开发的具有国 际先进水平的生物高科技成果，于1997 年 通过Ⅲ 期临床，并获得国家一类新药 证书，成为“863”计划生物技术领域第 一个实现产业化的基因工程药物。它源 于中国人基因，最适于黄种人使用。 • 目前我国已批准15种基因工程药物和疫 苗上市，在研究开发中的也有10余种。
3’ 3’
3’ 变性、退火 3’
延伸
变性、退火、延伸
PCR原理图
* （2）化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
• 亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定 在固相载体上完成 DNA 链的合 成的，合成的方向是由待合成引 物的 3' 端向 5' 端合成的，相邻的 核苷酸通过 3' → 5' 磷酸二酯键连 接，

基因工程制药2课件

基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：

生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)



Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化

反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA，而要 分离纯化目的基因的mRNA，其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA，mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 （polyA)组 成的末端，长达20~250个腺苷酸，足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的 作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被i洗脱下来， 经过两次寡聚(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的mRNA。

我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。 20 世纪70年代末以来，开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家 汁划，特别是国家"863"高技术计划的优先支持下， 使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点 是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。

3-4基因工程制药


重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建

人胰岛素原表达法 表达产物的后处理路线： B链中第22位上的Arg和第 29位上的Lys由于良好折 叠的原因，对胰蛋白酶不 敏感
R K
Cpeptide
R R
S S C S S S
R
K
胰蛋白酶
M
S
N
羧肽酶B
CNBr
S S N
胰蛋白酶
C
羧肽酶B
N
泰山学院生物工程与酿酒学院
生物技术制药 朱红艳
S
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建

A链和B链分别表达法 生产技术的评价：

由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配
对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工艺路线生产的重组
人胰岛素每克成本高达180美元以上。

为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二 条生产重组人胰岛素的工艺路线。
泰山学院生物工程与酿酒学院
生物技术制药
朱红艳
人胰岛素的生产方法

基因工程法制人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 ，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司又 推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性 能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代 动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免 疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药 领域中的巨大潜力。
泰山学院生物工程与酿酒学院
生物技术制药
朱红艳
人胰岛素的生产方法
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9
第二节
重组DNA技术的基本过程
1010
基本过程
（1）获得目的基因； （2）构建DNA重组体； （3）将重组体导入宿主细胞； （4）工程菌的克隆与鉴定； （ 5 ） 目 的 基 因 扩 增 与 蛋 白 表 达 。
11 11
重组DNA技术的特点：
1 不受亲缘关系的限制，打破物种界限； 2 定向地改变物种的遗传特性； 3 增加目的基因的含量，提高基因产物的水平。
2727
回文序列
A palindromic sequence is a nucleic acid sequence (DNA or RNA) that is the same whether read 5' (five-prime) to 3' (three-prime) on one strand or 5' to 3' on the complementary strand with which it forms a double helix
真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中的很小 一部分，从染色体中直接分离纯化目的基因难度很 大。而且真核基因含有内含子，即使将其导入了原 核细胞，由于缺乏相应的细胞器对mRNA进行加工， 也不能对其进行克隆。
获得方法
反转录法 化学合成法
1818
反转录法 先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进
段分别克隆进载体，再对带有外源DNA片段的重组克隆进 行鉴定、分离，再培养和进一A ① mRNA的分离 ② cDNA第一链的合成 ③ cDNA第二链的合成 ④ cDNA与载体连接 ⑤ 转染或转化 ⑥ 筛选目的克隆
1717
真核目的基因的获得
基因工程 将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基 因能够在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作过程。
基因工程药物 采用基因工程的技术方法，利用细菌、酵母或哺乳动物
细胞作为活性宿主，所生产的作为治疗、诊断等用途的多 肽和蛋白质类药物称为基因工程药物。
5
基因工程药物通常分为4类： 激素和多肽类、酶、重组疫苗、单克隆抗体
为模板，由引物起始从5’→3’延伸。
2121
PCR
2222
目的基因的表达
目的基因所携带的遗传信息，经过极其复杂的 生物化学反应，最终产生具有生物功能的蛋白质 的过程。
宿主细胞
原核细胞 eg. 大肠杆菌，枯草芽 孢杆菌，链霉菌等
真核细胞 eg. 酵母菌、丝状真菌、 哺乳动物细胞等
2323
宿主细胞显微镜下照片
体载体、病毒载体、以及由它们相互组合或与其他 基因组DNA组合成的载体
5'- G A A T T C -3' 3'- C T T A A G -5'
2828
粘性末端
2929
连接酶：将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。 具有分子“缝合”作用。可催化DNA片段的5’磷酸
基与3’羧基之间形成磷酸二酯键，连接时需要ATP作 为辅助因子。
3030
其他工具酶： DNA聚合酶，反转录酶，T4 多核苷酸激酶，碱性
行cDNA 序 列 或 多 肽 的 一 般 结 构 时 ， 如 链 长 在
60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。
2020
PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）
典型PCR反应包括：
①模板变性 94℃以上(1～2’) ②退 火 50～55℃(1～2’) ③延 伸 72℃ (1～2’) 在高温聚合酶作用下，以DNA单链
第三章 基因工程制药技术
1
第一节 概述
22
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
1212
质粒DNA
酶切
外源DNA
酶切
质粒
引入受体
染色体
由细胞分裂 来增殖
基因工程操作过程模式图
13
基因的表达系统：
原核生物系统 真核生物系统
1414
基因表达系统的选择： 1、要保证所表达蛋白的功能； 2、蛋白表达量的多少和分离纯化的难易。
1515
原核目的基因的获得基因组DNA的建立 用限制性内切酶对细胞总DNA酶解，然后把这些酶解的DNA片
2424
第三节
基因工程工具酶和克隆载体
2525
基因工程的常用酶
基因工程的操作依赖一些工具酶对基因进行人工切 割和拼接等操作。
限制性内切酶 连接酶 修饰酶
2626
识别和切割双链DNA分子内特殊的核苷酸序列的 NDA水解酶称为限制性内切酶。
Ⅱ类限制性内切酶的主要作用是切割DNA分子，便 于对含有特定基因的DNA片段进行分离和分析，是 基因工程中使用的主要的工具酶。
人胰岛素（Insulin）
6
3D Structure of Insulin
胰岛素二聚体 （ dimer） 胰岛素六聚体（hexamer ）
7
基因工程制药的发展
美国是应用现代生物技术研制新型药物最多的国家， 其基因工程药物的研发也处于世界先进水平。
1971年，第一家生物制药公司Cetus在美国成立。 目前美国已经有1300多家生物技术公司.
1982~1998年的16年时间里，已经有53种基因工程 药物获得FDA批准上市，广泛应用于治疗癌症、多发性硬 化症、糖尿病、肝炎及一些罕见的遗传性疾病。
8
我国基因工程发展的现状 第一个在我国生产的基因工程药物 ——重组人干扰素α1b 第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物。 目前我国已有15中基因工程药物和若干种疫苗批准上市。
磷酸酶等。
3131
克隆载体
外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌 和动物受体细胞，这种能承载DNA片段并带入受体 细胞的传递者称为基因工程载体。
基本条件：1.能够进入宿主细胞；2.可以在宿主细 胞中独立复制；3.有筛选标记；4.有单一或较少的 酶切位点。
分为三大类：1.克隆载体 2.穿梭载体 3.表达载体 目前已构建应用的基因工程载体：质粒载体、噬菌