第6章基因工程制药工艺-1
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基因工程制药工艺
YIp酵母整合载体：选择标记和MCS，无自主复制序
列，有整合序列。同源重组整合到酵母染色体，随同染色 体一起复制和遗传。
YCp酵母着丝粒载体：着丝粒序列和自主复制序列。
可自主复制，拷母复制载体：酵母基因组DNA复制序列，可独
载体：安全、无毒 营养缺陷选择外来质粒 培养条件简单，大规模培养技术成熟 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和 加工，并具有良好的蛋白质分泌能力 缺点： 酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用
4、应用
1981年，Nature，Hitzeman等在酵母中表 达人干扰素 激素类：67种人胰岛素及1种突变体，尿酸 水解酶和水蛭素 细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子 多肽类：高血糖素 2种乙肝疫苗等
生物制药工程
主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@ 山东农业大学生命科学学院微生物系
第六章 基因工程制药工艺
6.1 基因工程制药微生物表达系统 6.2 基因工程大肠杆菌的构建 6.3 基因工程菌的发酵培养与控制
基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：实验室内完成
生长繁殖迅速，倍增期约2 h
酿酒酵母有17条染色体 1996年完成其全基因组测序，遗传背景相对清楚 基因组：120.68 Mbp，5887个ORF，编码约 6000个基因
表达载体—穿梭载体
含有复制起始序列或整合序列、选择标记 以及由启动子、终止子和信号肽序列构成 的表达盒序列。 四种类型
YIp酵母整合载体 YCp酵母着丝粒载体 YRp酵母复制载体 YEp酵母附加载体
3、质粒载体
基因工程制药技术 基因工程操作流程
四、重组DNA导入受体菌2、导入方式转导（transduction）通过病毒将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象
Part2 基因工程操作工具
四、重组DNA导入受体菌2、导入方式显微注射通过微量注射器将重组DNA直接注入受体细胞中基因枪
基因枪
显微注射
Part2 基因工程操作工具
Part2 基因工程操作工具
五、重组体的筛选1、直接选择法标志补救（marker rescue）若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选
Part2 基因工程操作工具
五、重组体的筛选1、直接选择法利用报告基因筛选植物转化细胞在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因（reportor gene），常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接1、连接工具T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶2、连接方式粘性末端连接（1）同一限制酶切位点连接
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接2、连接方式粘性末端连接（2）不同限制酶切位点连接
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接2、连接方式平末端连接适用于限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端
Part2 基因工程操作工具
四、重组DNA导入受体菌1、受体细胞是指能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态（competent）种类微生物受体细胞（原核、真核） 植物受体细胞动物受体细胞
Part2 基因工程操作工具
Part2 基因工程操作工具
四、重组DNA导入受体菌2、导入方式显微注射通过微量注射器将重组DNA直接注入受体细胞中基因枪
基因枪
显微注射
Part2 基因工程操作工具
Part2 基因工程操作工具
五、重组体的筛选1、直接选择法标志补救（marker rescue）若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选
Part2 基因工程操作工具
五、重组体的筛选1、直接选择法利用报告基因筛选植物转化细胞在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因（reportor gene），常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接1、连接工具T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶2、连接方式粘性末端连接（1）同一限制酶切位点连接
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接2、连接方式粘性末端连接（2）不同限制酶切位点连接
Part2 基因工程操作工具
三、目的基因与载体的连接2、连接方式平末端连接适用于限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端
Part2 基因工程操作工具
四、重组DNA导入受体菌1、受体细胞是指能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态（competent）种类微生物受体细胞（原核、真核） 植物受体细胞动物受体细胞
Part2 基因工程操作工具
《基因工程制药技术》课件
02
该系统可用于生产具有治疗价值 的蛋白质药物，如疫苗、抗体等
。
转基因植物表达系统的优点是生 产成本低，且易于大规模生产。
03
缺点是可能存在食品安全和环境 问题，需要加强监管和控制。
04
04 基因工程制药的挑战与前 景
安全性问题
基因工程制药产品的安全性是首要考 虑的问题，需要经过严格的临床试验 和审批程序，确保产品的安全性和有 效性。
02 基因工程制药技术的基本 原理
基因克隆与表达
基因克隆
01
通过特定的方法将目的基因从生物体中分离出来，并在体外进
行复制和扩增的过程。
基因表达
02
在细胞内，基因通过转录和翻译过程，将遗传信息转化为蛋白
质的过程。
基因克隆与表达在制药工业中的应用
03
利用基因克隆技术获取药物靶点基因，通过基因表达技术生产
未来发展前景与展望包括开发更加高效和精准的基因工程制药技术、拓展新的治 疗领域和应用范围、降低生产成本和提高可及性等，需要加强研发和创新投入， 推动基因工程制药技术的可持续发展。
பைடு நூலகம்
05 基因工程制药的案例分析
胰岛素的基因工程生产
总结词
通过基因工程技术，将胰岛素基因转入到大肠杆菌或 酵母菌中，实现大规模生产。
感谢您的观看
THANKS
具有生物活性的蛋白质药物。
重组DNA技术
01
重组DNA技术
通过人工方法将不同来源的DNA片段进行剪切、拼接和重组，形成新
的DNA分子。
02
重组DNA技术在制药工业中的应用
利用重组DNA技术构建基因表达载体，将目的基因导入受体细胞，实
现目的基因的高效表达。
第32讲 第六章 基因工程制药技术(4)
乙肝疫苗
pADR-1，pYPH-203，YEp-13
转化，筛选 宿主AZ2（Leu－）
限制酶切，连接
EcoRI，Sal I， XboI，ligase
pYPH-SE（重组质粒）
重组酵母细胞
发酵培养 YPD培养液 30℃，24～30h
发酵液
细胞破碎，提取 超声波处理 PBS抽提
HBsAg提取液
纯化、精制 Sepharose 4B亲和层析，HBs吸附；pH2.8Gly-HCl洗脱
人生长激素的生产
• 最初使用动物来源的生长激素，但发现效果很小， 或根本没有。 • 1956年，首次从捐献的人脑垂体中提取得到生长 激素，用于临床试验，但治疗一个侏儒患者约需 要50个人的脑垂体。 • 1986年，首次将人生长激素在大肠杆菌中表达成 功。 • 1989年，第一个产自哺乳动物细胞系统的重组生 长激素问世。 从此，可以大批量生产人生长激素用于临床，侏 儒等生长激素异常患者有了治疗的可能。
IFN-ω属于IFN-α家族，其结构和大小与其它IFNα稍有差异，但抗原性有较大的不同
干扰素
干扰素的作用
• • • • 诱导细胞对病毒攻击的抗性 调节多种免疫功能 调节许多细胞类型的生长和分化 在某些动物中支持早期妊娠
干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。由于几乎能抵 抗所有病毒引起的感染，如水痘、肝炎、狂犬病等病毒引 起的感染，因此它是一种抗病毒的特效药。此外，干扰素 对治疗乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌症和某些白血病也有 一定疗效。
人生长激素异常症
• 幼年时，如果生长激素分泌不足，会导致生长发 育迟缓，身体长得特别矮小，称“侏儒症”； • 如果生长激素分泌过多，可引起全身各部过度生 长，骨胳生长尤为显著，致使身材异常高大，称 “巨人症”。 • 成年后，骨骺已融合，长骨不再生长，此时如生 长激素分泌过多，将刺激肢端骨、面骨、软组织 等增生，表现为手、足、鼻、下颌、耳、舌以及 肝、肾等内脏显示出不相称的增大，称“肢端肥 大症”。
《基因工程制药》课件
、改变细胞特性等。
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
基因工程制药新版(1)
（2）低温条件----防止DNA在振荡、机械操作过程 中的降解、断裂。
（3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTA） ----以防止DNA被酶解。
2、提取方法
（1）机械法----破坏细胞，释放出DNA。
（2）酶消化法---破坏细胞，释放出DNA。
（3）用酶使蛋白质变性----除去蛋白质之后，就剩 下DNA。
物理学密度梯度离心法
不同DNA片 段，其密度 不同，借此 进行密度梯 度离心，实 现分离。
凝胶电泳分离技术
通过凝胶电泳， 分段收集大小不 同的DNA片段，
然后用快速转化 法来检验其目的 蛋白质，进行基 因定位。实现分 离。
（2）物理分离法实例
海胆组蛋白基因 苏芸金杆菌晶体蛋白基因 多角病毒的多角体蛋白基因 β-半乳糖苷酶蛋白基因
（4）用酚、去垢剂使蛋白质变性----除去蛋白质， 剩下DNA。
3、分离方法
是指从大分子的 混合物中分离出 DNA。具体方法 有： （1）DEAE—纤维 素柱层析法。 （2）羟基磷灰石 柱层析法。
4、纯化方法
分子筛层析法。 凝胶电泳法。 乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。
（二）不同类别DNA的提取技术
三、外源DNA和目的基因的分离和获得
（一）基本操作方法 （二）不同类别DNA的提取技术 （三）目的基因的制备
（一）基本操作方法
细胞内的DNA大多与RNA及蛋白质形成复合物，需 要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的DNA。
1、操作条件 2、提取方法 3、分离方法 4、纯化方法
1、操作条件
（1）含盐的中性缓冲液----的提取
（1）提取方法 同2
（2）注意事项 对于纯度要求较高的DNA，必须采用氯化铯（CsC
（3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTA） ----以防止DNA被酶解。
2、提取方法
（1）机械法----破坏细胞，释放出DNA。
（2）酶消化法---破坏细胞，释放出DNA。
（3）用酶使蛋白质变性----除去蛋白质之后，就剩 下DNA。
物理学密度梯度离心法
不同DNA片 段，其密度 不同，借此 进行密度梯 度离心，实 现分离。
凝胶电泳分离技术
通过凝胶电泳， 分段收集大小不 同的DNA片段，
然后用快速转化 法来检验其目的 蛋白质，进行基 因定位。实现分 离。
（2）物理分离法实例
海胆组蛋白基因 苏芸金杆菌晶体蛋白基因 多角病毒的多角体蛋白基因 β-半乳糖苷酶蛋白基因
（4）用酚、去垢剂使蛋白质变性----除去蛋白质， 剩下DNA。
3、分离方法
是指从大分子的 混合物中分离出 DNA。具体方法 有： （1）DEAE—纤维 素柱层析法。 （2）羟基磷灰石 柱层析法。
4、纯化方法
分子筛层析法。 凝胶电泳法。 乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。
（二）不同类别DNA的提取技术
三、外源DNA和目的基因的分离和获得
（一）基本操作方法 （二）不同类别DNA的提取技术 （三）目的基因的制备
（一）基本操作方法
细胞内的DNA大多与RNA及蛋白质形成复合物，需 要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的DNA。
1、操作条件 2、提取方法 3、分离方法 4、纯化方法
1、操作条件
（1）含盐的中性缓冲液----的提取
（1）提取方法 同2
（2）注意事项 对于纯度要求较高的DNA，必须采用氯化铯（CsC
基因工程制药1
程
制 3.应用基因工程技术生产药物有何优点？
药
4.基因工程药物制造的基本过程。
5.目的基因的获得有哪些方法？
6.能否直接分离克隆真核基因用于基因药物生产？
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
RT-PCR
5
基
5
因
工
程
制
5
药
5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
Biotechnological Pharmaceutics
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
RT-PCR
基 因 工 程 制 药
Biotechnological Pharmaceutics
基 1、mRNA purification
因 工
细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，
程
相对分子量大小不一致，分离困难。
制 药
但是mRNA的3’末端常含有一poly A组成的末端，长
达20-250个腺苷酸，足以吸附于Oligo-纤维素上，从
而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离
药
酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连
接等分子克隆操作。
Biotechnological Pharmaceutics
主要包括:
工程菌大规模发酵最佳参数的确立
基
因 新型生物反应器的研制
工
程 高效分离介质及装置的开发
制
药 分离纯化的优化控制
高纯度产品的制备技术
生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造
生物制药--基因工程制药--ppt课件可编辑全文
组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 （oligo-dT 亲和层析法）
• 借助于逆转录酶，以 mRNA 为模板，以 oligo-dT 为引物， 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链； • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增，即“逆转录
－PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法：将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段，然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增， 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性，酶切位点丰富。含 T7lac 启动子；含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签，便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC（平末端）
Haemophilus parainfluenzae
基因工程制药—基因工程制药技术
工程菌培养 ↓
产物分离纯化
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或 细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成。
下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规 模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。
（一）基因工程菌的构建与筛选 将目的基因与载体连接后，转入受体细胞，即获得基因工程菌 该过程也称为基因工程的上游技术
3、培养温度 （1）在复制水平上，温度可影响基因拷贝数量 （2）在转录水平上，温度可影响RNA聚合酶的作用 （3）在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质合成水平来影响基因表达 （4）温度还影响蛋白质的活性和包涵体的形成 例如，重组人生长激素工程菌，在30℃时的产物是可溶的，而在37℃所表达出的蛋 白质则是不溶的
1、目的基因的制备 （1）化学合成法：将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直接合成。 特点： • 只能合成小于100个碱基的特定序列 • 自动化程度高RNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接， 转效表达和翻译需要维持较高水平的溶氧。 通常采用改变转速的方法，改善氧的供给 5、pH的影响 影响细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达。
6、诱导时机的影响 案例1 重组苏氨酸脱水酶的基因表达
不同诱导时机对重组苏氨酸脱水酶的影响
案例2 L-天冬氨酸酶的表达
诱导时机对L-天冬氨酸酶表达水平和活力的影响
2、载体
载体是携带外源目的基因或DNA进入宿 主细胞，实现外源基因无性繁殖或表达有 意义蛋白质所采用的DNA分子。
包括质粒载体、病毒（包括噬菌体）等。
基因工程载体必备条件 • 具有有效运载能力 • 载体自身能够独立复制，并能在宿主内进行自主性复制 • 必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上 • 必须带有标志基因，以便进行重组后的筛选
产物分离纯化
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或 细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成。
下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规 模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。
（一）基因工程菌的构建与筛选 将目的基因与载体连接后，转入受体细胞，即获得基因工程菌 该过程也称为基因工程的上游技术
3、培养温度 （1）在复制水平上，温度可影响基因拷贝数量 （2）在转录水平上，温度可影响RNA聚合酶的作用 （3）在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质合成水平来影响基因表达 （4）温度还影响蛋白质的活性和包涵体的形成 例如，重组人生长激素工程菌，在30℃时的产物是可溶的，而在37℃所表达出的蛋 白质则是不溶的
1、目的基因的制备 （1）化学合成法：将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直接合成。 特点： • 只能合成小于100个碱基的特定序列 • 自动化程度高RNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接， 转效表达和翻译需要维持较高水平的溶氧。 通常采用改变转速的方法，改善氧的供给 5、pH的影响 影响细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达。
6、诱导时机的影响 案例1 重组苏氨酸脱水酶的基因表达
不同诱导时机对重组苏氨酸脱水酶的影响
案例2 L-天冬氨酸酶的表达
诱导时机对L-天冬氨酸酶表达水平和活力的影响
2、载体
载体是携带外源目的基因或DNA进入宿 主细胞，实现外源基因无性繁殖或表达有 意义蛋白质所采用的DNA分子。
包括质粒载体、病毒（包括噬菌体）等。
基因工程载体必备条件 • 具有有效运载能力 • 载体自身能够独立复制，并能在宿主内进行自主性复制 • 必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上 • 必须带有标志基因，以便进行重组后的筛选
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4、产物表达形式
• 不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体 • 可溶性蛋白质：存在于细胞质 • 周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质空间，可溶性 • 胞外表达：胞内可溶性蛋白质分泌到培养液中
5、大肠杆菌表达系统的问题 缺点:
1）缺乏翻译后修饰，如糖基化
2）常形成包涵体，复性效果差
3）蛋白质易被降解 4）内毒素难以除尽，产生热源 5）N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应 优点: 1）简单，经济，快速
酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用
4、应用
• 1981年，Nature，Hitzeman等在酵母中表达人干扰素 • 激素类：67种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素
6.1.1 大肠杆菌系统
1、大肠杆菌（Escherichia coli）形态特征
细胞：G-，单细胞，杆状，鞭毛，无芽孢，一般无 荚膜。裂殖。
菌落：白色至黄白色，光滑，直径2~3mm
• 2、生化与遗传特性
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐 的极限培养基上生长，发酵糖，产气、产酸。 繁殖一代约17min 基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株 基因组：4.6 Mbp，3000多种蛋白质 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒
12. 琼脂糖电泳 13. 蛋白质纯化
14. SDS-PAGE 15. 微生物发酵技术 16. 动物细胞培养技术 17. 熟悉DNA分析软件 18. 熟悉分子生物学常用网站
基因工程菌
• 概念：以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基 因，或过量表达或抑制自身基因的工程生物体。
• 种类： 基因工程大肠杆菌和酵母：重组蛋白质药物 基因工程技术改造出发菌：氨基酸、抗生素、甾体激素、中间体生 产
表达载体—穿梭载体
• 含有复制起始序列或整合序列、选择标记以及由启动子、终止子和 信号肽序列构成的表达盒序列。
• 四种类型
YIp酵母整合载体 YCp酵母着丝粒载体 YRp酵母复制载体 YEp酵母附加载体
• YIp酵母整合载体：选择标记和MCS，无自主复制序列，
有整合序列。同源重组整合到酵母染色体，随同染色体一 起复制和遗传。
• YEp酵母附加载体：复制子，可自主复制，高拷贝，转
化频率高。改造后，无需选择压就能高拷贝稳定分配，在 大规模无选择培养中是非常有用的，用于过量表达外援基 因。
3、优点与不足
• 载体：安全、无毒 • 营养缺陷选择外来质粒 • 培养条件简单，大规模培养技术成熟 • 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加 工，并具有良好的蛋白质分泌能力 • 缺点：
• YCp酵母着丝粒载体：着丝粒序列和自主复制序列。可
自主复制，拷制载体：酵母基因组DNA复制序列，可独立
自主复制，转化效率高。但存在分配不均一性，母细胞中 远远多于子细胞中。无选择压，容易丢失。常用于试验研 究，很难工业化应用。
2）适合于制备抗体，供下游研究
பைடு நூலகம்、应用
• 大量外源基因能超量的表达，18种药物上市 • 多肽类：2种（甲状旁腺激素1-34、利尿钠肽） • 激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素（1种PEG 化）
• 细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干扰素β 和γ，2种G-CSF（1种PEG化）、白介素-2、白介素11、白介素-1拮抗剂 • 溶栓酶类：rPA（reteplase，瑞替普酶） • 白喉毒素-1L 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等
生物制药工程
第六章 基因工程制药工艺
• 6.1 基因工程制药微生物表达系统 • 6.2 基因工程大肠杆菌的构建 • 6.3 基因工程菌的发酵培养与控制
基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：实验室内完成
克隆目的基因 目的基因的表达
下游阶段：将实验室的成果产业化、商品化 工程菌大量培养 产品的分离纯化和质量控制。
6.1.2 酵母表达系统
1、形态特征
细胞：单细胞真核生物，球形，椭圆形，卵形 繁殖：芽殖、裂殖，在特定条件下才产生子囊孢子 菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐
2、生长与遗传特征
• 两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体结合子 或营养细胞，进行芽殖。 • 能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。 • 生长繁殖迅速，倍增期约2 h • 酿酒酵母有17条染色体 • 1996年完成其全基因组测序，遗传背景相对清楚 • 基因组：120.68 Mbp，5887个ORF，编码约6000个 基因
3、质粒载体
选择标记 复制子
多克隆位点
质粒载体的基本特征
• 自主复制性：复制子—复制起始点及控制复制频率的调控 元件。质粒DNA不依赖于染色体DNA而自主复制。 • 选择标记：质粒编码的选择标记，产生一种新的表型， 用于转化体的筛选。如：抗生素抗性基因，氨苄、四 环素、卡那等。 • 多克隆位点：外源基因插入载体的位置，由多种常见的 限制性内切酶位点序列构成。 • 不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的两种不 同质粒不能稳定地存在于同一宿主细胞内。 • 转移性：通过细菌接合作用从一个宿主转移到另一个宿 主细胞/菌
基因工程药物研究的技术路线-上游技术
目的基因克隆 酶切
质粒提取、酶切 连接、转化
PCR筛选，酶切确认，提取质粒测序
转化宿主细胞 诱导表达
分离纯化目的蛋白
基因工程药物涉及的技术
1. RNA提取及操作, 防RNA酶 2. 引物设计 3. cDNA合成
4. PCR 5. 质粒提取 6. 限制性内切酶操作 7. DNA连接 8. 制备大肠杆菌感受态细胞 9. 转化大肠杆菌 10. 无菌操作 11. 制备各种培养基
质粒类型
• 严谨型质粒：每个细胞含少数拷贝质粒 • 松弛型质粒：每个细胞含几十至几百拷贝质粒 • 克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因 • 测序质粒：用于基因测序 • 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合 • 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在 • 表达质粒：能表达基因产物
表达载体MCS附近结构
1.启动子 2.操纵子 3.核糖体结合位点 4.MCS 5.终止子