《基因工程制药新版》PPT课件

至2004年，FDA共批准了大肠杆菌表达的基 因重组生物技术药物18种：
重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、 白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。
（2）枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
2、宿主细胞的类型
原核细胞类：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。 真核细胞类：酵母菌、丝状真菌、动物细胞、昆虫细
胞和植物细胞。
（1）大肠杆菌 （2）枯草芽孢杆菌 （3）链霉菌 （4）酵母菌 （5）丝状真菌 （6）动物细胞
（1）大肠杆菌
优点： （1）生长迅速、大规模发酵经济。 （2）分子遗传结构清楚、操作简单。 （3）基因工程研究中采用最多的表达体系。
缺点： （1）表达产物多为胞内物质，提取时需破碎细胞。 （2）细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出 来，形成杂质。给提取带来困难。 （3）所表达的真核蛋白质在其体内常形成包含体，在 提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。 （4）大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统，不能对蛋白 产物进行糖基化及磷酸化等修饰。 （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难去除。
（3）感受态细胞
感受态(competent) :指细胞在一定的生理状 态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色 体中的一部分,导致受体细胞某些遗传性状的 改变。
（4）人工感受态细胞
在基因工程中，宿主细胞经过人工处理，最后 成为感受态细胞，称为人工感受态细胞。所有 生物细胞均可处理成人工感受态细胞。
（3）链霉菌
优点： （1）不致病， （2）使用安全， （3）分泌能力强， （4）可将培养产物直接分泌到培养液中， （5）具有糖基化能力
近年来，作为外源基因表达体系，正日益受到人 们的重视。
（4）酵母菌
酿酒酵母研究最为透彻。干扰素和乙肝表面抗原基因在 酵母菌中进行克隆和表达。 优点： （1）是研究基因表达调控最有效的单细胞真核生物， （2）其基因组小、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行 大规模培养， （3）无毒性， （4）基因工程操作简单， （5）表达的蛋白质产物能够直接分泌出细胞外， （6）能够对蛋白质产物进行糖基化， （7）真核基因在酵母中表达良好。
（5）丝状真菌
曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了 成熟的发酵和后处理工艺。 • 优点： （1）有很强的蛋白质分泌能力， （2）能正确地进行翻译后的加工，如进行糖基化、 肽剪切。
（6）动物细胞
优点： （1）表达产物可以分泌到培养液中， （2）培养液成份完全由人所控制， （3）所分泌的基因产物接近于天然产物， （4）产物容易得到提纯。
第三节 基因工程制药生产的基本过程
一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例
五、宿主细胞的选择和基因导入操作
体外重组的DNA分子，如果不引入到宿主细胞，则无法显 示其生命力，而只是表现出纯粹的试剂性质。随着时间的 推移而逐渐失活。
（一）宿主细胞的选择 （二）具体的转移技术 （三）大肠杆菌中的基因导入和表达 （四）酵母菌中的基因导入和表达 （五）动物细胞中的基因导入和表达
（一）宿主细胞的选择
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
至2004年，FDA共批准了哺乳动物细胞表达 的基因重组生物技术药物53种，其中激素类 5种，酶7种，细胞因子7种，凝血因子5种， 治疗性抗体17种。
主要基因工程表达体系比较
表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性
1、转化作用
（1）基本概念 （2）转化作用的特性 （3）感受态细胞 （4）人工感受态细胞 （5）转化程序 （6）影响转化的因素
（1）基本概念
转化 (transformation)：
以质粒为载体构建的重 组DNA分子导入原核细胞 的过程.
（2）转化作用的特性
（1）是自然界经常发生的现象之一。 （2）转化作用的前提条件是宿主细胞必须转变为感受态细胞。 （3）转化作用的先决条件是要获得携带目的基因的重组DNA分子。
大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 融合蛋白质
容易
一般
部分高产
对原核好 对真核差
不大
酵 母 多肽蛋白质 菌体内 糖基化蛋白 外分泌
容易 可高产
菌体内 真核的接近 稍复杂 天然产物
不大
哺乳动物 完 整 外分泌 糖基化蛋白
较难成本高 简单 可高产
可达天然 产物
需注意 致癌
（二）具体的转移技术
1、转化作用 2、转导作用
1、宿主细胞应满足的条件 2、宿主细胞的类型
1、宿主细胞应满足的条件
（1）容易获得较高浓度的细胞。 （2）能够利用廉价原料进行生产。 （3）不致病。 （4）不产生内毒素。 （5）发热量低。 （6）需氧低。 （7）具有一定的细胞形态。 （8）需有适当的发酵浓度。 （9）容易进行代谢调控。 （10）容易进行DNA重组技术操作。 （11）产物的产量稳定、产率高。 （12）产物容易提取和纯化。
至2004年，FDA共批准了酵母表达的基因重 组生物技术药物8ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ：
胰高血糖素、巨细胞集落刺激因子、乙肝 疫苗、胰岛素（Novolin）、水蛭素等。
虽然酵母表达系统表达的蛋白质有糖基化 修饰，但是糖链结构和组成与天然糖蛋白相 差甚远，对于那些糖链极大影响生物活性的 蛋白质，如EPO、治疗性抗体等，仍不能用酵 母表达系统表达。
制备人工感受态细胞的方法： （1）将对数生长期细胞于低温、低渗的CaCl2 溶液中处理，就可成为感受态细胞。 （2）用MgCl2、CsCl、LiCl、或者是多价阳离 子DETE-Sephadex处理，改变细胞膜结构，也 能成为感受态细胞。