第三章基因工程制药第一节：基因工程制药基本环节基因工程技术六个基本过程：分离→酶切→连接→转化→筛选→验证。
（一）基因工程中常用的工具酶：ⅰ：核酸限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并进行切割的水解酶，简称内切酶。
主要存在于原核微生物中。
（1）限制和修饰系统：原核微生物中存在限制性内切酶及甲基化酶，它们对DNA底物有相同的识别序列，但有相反的生物功能。
而甲基化酶具有宿主专一性，可识别宿主双链DNA分子的特定序列进行甲基化修饰，而不修饰外源性DNA分子，从而避免了限制酶对宿主DNA的降解。
（2）限制性内切酶的分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
其中Ⅱ型限制性内切酶识别和切割产物是特异性的。
（3）Ⅱ型核酸限制性内切酶：1．酶切方式有两种：①断裂位置交错，形成粘性末端，又可分为从5′粘性末端和3′粘性末端；②对称轴处断裂形成平头末端。
2．同裂酶：是指来源不同，识别序列相同的酶，其切割位点同，产生平头或粘性末端。
3．同尾酶：来源和识别序列都不同，但切割后产生相同的粘性末端的酶。
4．限制性内切酶产生的末端的连接方式有三种：①匹配粘性末端的连接②平端连接③不匹配粘性末端的连接（有两种：67）5．限制性内切酶反应的影响因素：DNA的纯度、反应速度、反应体系的缓冲液、酶量、体积、时间、DNA甲基化程度、DNA的分子构型等。
ⅱ：DNA连接酶：是指催化两条分别具有5′-磷酰基末端与3′-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶。
目前使用的DNA连接酶:T4噬菌体DNA 连接酶、大肠杆菌（E.coli）DNA连接酶。
特点1．T4-连接酶：能够连接含粘性末端或平头末端连接的DNA片段或双链DNA 的切口。
连接反应中 ATP+作能源辅助因子。
2．大肠杆菌：只能连接粘性末端DNA片段或双链DNA的切口，不能连接平头末端DNA片段。
在连接反应中用NAD+作能源辅助因子。
ⅲ：聚合酶：（68）（二）载体：概念：（1）载体：是指凡来源于质粒或噬菌体的ＤＮＡ分子，可以供插入或克隆目的基因ＤＮＡ并具有运载外源ＤＮＡ导入宿主细胞能力的片段。
