AOEB染色的讨论

细胞成脂油红O染色以及成肌吉姆萨染色油红O染色注：操作过程中往培养皿中加液体时要沿壁轻轻加入一、0.2% 油红O工作液的配制：1．油红O粉与异丙醇比例为300mg/100ml，将称好的油红O 粉用100%异丙醇充分溶解配制成饱和溶液2. 油红饱和溶液与超纯水以3:2比例充分混合均匀，配制成0.2%油红O工作液3. 0.2?m无菌滤器过滤后即可使用注：油红O工作液在室温下保存时间最多不超过2h，所以应当严格注意现配现用二、10%甲醛固定液的配制取30ml超纯水加入10ml 40%甲醛溶液，混合均匀后配制成10%的甲醛固定液三、60%异丙醇孵育液将30ml 100%异丙醇与20ml超纯水混合均匀，制成60%异丙醇孵育液四、油红O与苏木素染色1.将培养皿中的培养基弃去，用PBS洗3次2.加入2.4ml 10%甲醛溶液对细胞进行固定1h3.弃去甲醛固定液，用超纯水冲洗3次4.往培养皿中加入2.4ml 60%异丙醇溶液孵育2min5.弃去60%异丙醇，加入1ml配置好的油红O染液，染色10min6.弃掉油红，用去离子水冲洗数次，至弃液澄清无色7.加入1ml苏木素染色液室温染色1min8.弃掉苏木素，用超纯水冲洗数次，至弃液澄清无色9.加入0.1%氨水溶液显色，然后用超纯水冲洗3次10.最后往各培养皿中加入少量去离子水，保持细胞湿润，染色后的细胞置于倒置显微镜下进行细胞形态的观察五、油红OD值的测定1.将上述用油红O染色后的细胞培养皿中的液体吸掉2.向培养皿中加入3.6ml 100%异丙醇，室温孵育10min，将细胞中的油红洗脱到异丙醇中3.将洗脱下的油红吹打混合均匀，加入到5ml离心管中，摇匀4.吸取200?l 洗脱液加入到96孔酶标板上，每个培养皿测3次重复5.用酶标仪在520nm波长下测定OD值，以100%异丙醇作为空白对照调零吉姆萨染色1.弃去培养皿内的培养基，用PBS反复漂洗2次2.加入PBS溶液，再加入等体积无水甲醇，边加边混合静止10min（在摇床上添加，各加2ml）3.将50%甲醇与PBS混合液弃去，加入新鲜的甲醇液浸泡（各加2ml），固定细胞10min，然后用PBS漂洗细胞1次4.每孔各加入1ml吉姆萨染色（吉姆萨染液可重复利用），覆盖细胞层，染色2min5.回收染色液，用去离子水冲洗细胞6.各培养皿加少量水，用显微镜观察单层潮湿的细胞。

吖啶橙/溴化乙锭双‎荧光染色AO / EB原理与‎流程zhong‎y ishe‎n g:1 原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜‎完整的细胞‎，嵌入细胞核‎D NA，使之发出明‎亮的绿色荧‎光。

溴乙锭(E仅能透过‎胞膜受损的‎细胞，嵌入核DN‎A，发橘红色荧‎光。

凋亡的细胞‎呈现为染色‎增强，荧光更为明‎亮，均匀一致的‎圆状或固缩‎状、团块状结构‎。

非凋亡细胞‎核呈现荧光‎深浅不一的‎结构样特征‎。

二者形态迥‎然相异，很易判别。

在荧光显微‎镜下观察，可见四种细‎胞形态：活细胞(VN)，核染色质着‎绿色并呈正‎常结构；早期凋亡细‎胞(VA)，核染色质着‎绿色呈固缩‎状或圆珠状‎；非凋亡的死‎亡细胞(NVN)，核染色质着‎橘红色并呈‎正常结构；晚期凋亡细‎胞(NVA)，核染色质为‎橘红色并呈‎固缩状或圆‎珠状。

2 AO/EB染色及‎观察结果：取 20-100μl‎的1：100稀释‎的染色剂置‎于载玻片的‎贴壁细胞上‎室温下静置‎20min‎，PBS洗涤‎2-3遍，上覆盖玻片‎，荧光显微镜‎下观察结果‎并计数20‎-200个细‎胞。

ym105‎1: 1.能否提供具‎体实验步骤‎?2.您在文中所‎说的"1：100稀释‎的染色剂"是怎样稀释‎的?如何在载玻‎片上种上贴‎壁细胞?zhong‎y ishe‎n g:1 用1mlE‎P管稀释时‎，先取微量的‎染色剂，然后再取稀‎释剂（如BSA）加入EP管‎吹打即可。

2 消毒灭菌处‎理后的盖玻‎片平放入培‎养皿或中即‎可实验。

ym105‎1:我好像已明‎白具体过程‎了:首先要进行‎细胞爬片,然后将染色‎剂滴加在已‎爬有细胞的‎盖玻片上,温育后洗涤‎,再盖上盖玻‎片则可进行‎观察了.是这样吗?如果不经过‎爬片处理而‎将细胞进行‎消化,再将细胞和‎染色剂滴加‎在盖玻片上‎进行观察,行吗?zhong‎y ishe‎n g:的确，不经过爬片‎而是将贴壁‎细胞消化下‎来一样可以‎进行进一步‎的实验。

巴氏染色的几点体会李瑞祥熊灏靳敏巴氏（Papanicolaou）染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。

其适用于上皮细胞及间皮组织的标本。

是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法。

该染色法不但具有显示细胞核结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆受色鲜艳等特点，而且所染标本不易脱色，可长久保存。

对如何染好巴氏染色，笔者有以下几点体会，报告如下。

1 EA 36 染液pH值的测试EA 36 染液的酸碱度对巴氏染色的成功起着关键性作用，EA 36 染液由伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等染料配成。

伊红、亮绿、桔黄及俾麦棕等属于酸性染料。

在溶媒中其发色团是负离子部分。

发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而使胞浆显蓝色、绿色、桔黄色或红色。

但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH值而改变的。

在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电）。

在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电）。

所以必须把染液pH 值调至5.2为宜［1］。

EA 36 染液pH的调节，可用石蕊试纸法，也可用酸度计测试。

当然用酸度计法最为准确。

但以上方法均比较麻烦，同时还要受到仪器设备的限制，不方便。

本文采用一种简单方便的方法。

即用10%磷钨酸及饱和碳酸锂溶液直接测试。

具体做法是，拿一张滤纸先滴少量染液于纸上，若滴染液处呈紫色，说明染液偏碱，则滴加少量10%磷钨酸。

若显绿色，说明染液偏酸，则滴加少量饱和碳酸锂。

并充分混匀。

直至染液滴在纸上既显绿色又有红色，颜色鲜艳为宜。

用此法测试染液pH同用石蕊试纸法测试一样，同样可获得满意的染色效果。

磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力。

同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂。

可中和分色及蓝化时可能留下的少量酸或碱。

保证染色达到理想效果。

2 分色分色或酸化，对染色效果也很重要。

分色目的是去掉胞浆中染上的多余的苏木素，使胞核着色显示特异性。

因此，经分色后的胞浆在镜下观察应无色为佳。

若胞浆中还残留有苏木素染料，会影响EA 36 染液的着色。

巴氏染色法的原理及结果判读巴氏染色法，这个名字听起来像是某个高深莫测的化学实验，其实它就是一招能让细菌乖乖现身的“魔法”。

想象一下，科学家们在实验室里忙得不可开交，手里拿着一根小刷子，像是在给细菌涂抹化妆品，其实他们是在为细菌“上妆”，把它们变得更加引人注目。

这样一来，我们就能一眼看出它们是好是坏了，真是方便极了。

说到原理，巴氏染色法其实就是通过不同的染料，把细菌染成不同的颜色。

你瞧，染料有的像春天的花朵一样鲜艳，有的则深沉得像秋天的落叶。

比如，细菌被染上了紫色，那就说明它们是革兰阳性菌，换句话说，它们就像是穿着紫色外套的小可爱。

而如果是红色的，那就不那么讨喜了，说明它们是革兰阴性菌。

这时候，不妨想象一下，紫色的菌儿在舞台上跳舞，红色的则在角落里默默呜咽，生怕被发现。

哎，说到这里，不得不提一下这个染色过程。

实验室里总是弥漫着各种奇怪的气味，仿佛是化学实验的调色板。

科学家们会把细菌涂抹在玻璃片上，然后用火焰轻轻烤烤，嘿，这一步就像是给细菌做个小烤箱烤熟的感觉。

加入染料，紫色的、红色的，调皮的细菌们就开始“洗澡”了。

洗完澡之后，水一冲，染料随之而去，留下的就是那一抹亮丽的色彩。

结果判读就是另一番风味了。

你瞧，显微镜就像是一扇魔法窗户，让我们能看到那些微小的细菌世界。

科学家们紧盯着显微镜，像是在看一场精彩的戏剧。

紫色的小家伙们个个活泼好动，像是在舞台上肆意挥洒，红色的则显得有些沉闷，仿佛在琢磨人生的哲学。

通过这些颜色的对比，科学家们能够判断细菌的种类和特性，真是了不起。

不过，巴氏染色法并不是一成不变的。

这些细菌也会耍点小花样，颜色不够明显，或许是染料不够给力，或者细菌太顽皮。

这时，科学家们就得耐心对待，重复实验，调试染料的浓度，像是在调配一杯完美的鸡尾酒。

只有这样，才能让细菌们的真实面貌展现无遗。

对于那些刚入门的小伙伴来说，巴氏染色法就像是一场有趣的游戏。

每一步都充满了惊喜，结果也让人忍不住想要分享。

细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等。

目前常用的方法有很多,如有台盼蓝染色法、克隆(集落)形成法、H放射性同位素掺入法、MTT法等。

本文总结了一些常用的细胞活性检测方法的原理、特点，并对比了各自的优缺点。

一、染色计数法1. 化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。

可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。

使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。

能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。

其中最常用的是台盼蓝染色法。

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。

通过细胞计数可得出细胞的存活率。

本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。

但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。

而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。

2. 荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。

如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。

吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。

溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。

也可应用AO-EB双染法鉴定细胞死活。

这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。

在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。

缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。

而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。

dab染色原理DAB染色原理。

DAB（3,3'-二氨基联苯）是一种常用的组织化学染色试剂，广泛应用于免疫组化和组织化学实验中。

它的染色原理主要是通过酶标记技术来实现对目标蛋白的可视化检测。

在本文中，我们将对DAB染色原理进行详细介绍，以帮助您更好地理解其在实验中的应用。

DAB染色的原理基于酶标记技术，该技术利用特定的酶与抗体结合，然后通过酶底物的作用产生可见的染色反应。

在DAB染色中，常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），它能与抗体结合形成抗原-抗体-HRP复合物。

当这个复合物与其靶标蛋白结合后，就会在酶底物DAB的作用下产生棕色的沉淀物，从而实现对目标蛋白的可视化检测。

DAB染色的步骤主要包括抗体结合、酶底物作用和染色显色三个关键步骤。

首先，将样本组织或细胞切片与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

然后，将HRP标记的二抗加入到样本中，与抗体结合形成抗原-抗体-HRP复合物。

最后，加入DAB底物，HRP催化DAB氧化聚合生成可见的棕色沉淀物，从而实现对目标蛋白的染色显色。

DAB染色具有高灵敏度和特异性，能够清晰地显示目标蛋白的位置和表达水平。

同时，DAB染色也具有较好的稳定性和持久性，染色后的样本可以长时间保存而不会失去染色信号。

因此，DAB染色在免疫组化和组织化学实验中被广泛应用，成为一种重要的组织染色技术。

除了其应用的广泛性外，DAB染色还具有操作简便、成本低廉等优点，适用于大规模样本的染色实验。

因此，无论是在科研领域还是在临床诊断中，DAB染色都扮演着重要的角色，为科学研究和临床诊断提供了可靠的技术支持。

总结而言，DAB染色原理是基于酶标记技术实现对目标蛋白的可视化检测。

通过抗原-抗体-HRP复合物与DAB底物的作用产生可见的染色反应，从而清晰地显示目标蛋白的位置和表达水平。

DAB 染色具有高灵敏度、特异性、稳定性和持久性等优点，被广泛应用于免疫组化和组织化学实验中。

希望本文能够帮助您更好地理解DAB染色的原理和应用，为您的实验工作提供帮助。

1、免疫组化脱片产生的原因？
（1）多聚赖氨酸玻片质量有问题。

（2）组织切的不好，切片机的问题或者切片厚度不均匀。

（3）组织自身有坏死。

（4）片子没烤好，时间短、温度不够。

（5）操作的时候用力甩片会促使粘贴不牢固的组织片脱落。

（6）抗原修复的时候高压时间过长或者放进修复液时手法不好容易导致脱片。

此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。

（7）用PBS的时候尽量泡片，不要冲。

2、封闭血清的选择原则是什么？
为了防止组织或细胞切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！实验前应用血清进行封闭。

封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。

也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

3.原理：抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。

免疫酶染色技术正是根据此原理用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记已知抗体（或抗原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或抗体存在，抗原抗体就相互结合形成复合物，其中的酶分子遇到底物时，能催化底物水解、还原或氧化，产生颜色反应，从而可识别出标本中的抗原。

该方法具有敏感性高，标本可长期保存，而且使用一般光学显微镜就能观察等优点。

但有时也存在非特异性染色影响。

杨佳 10:41:29。

基因分子生物学实验——EB的染色原理溴化乙锭（EtBr，EB）为芳香族荧光化合物，是一种高度灵敏的嵌入性荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸。

是一种核酸染料，常在琼脂糖凝胶电泳中用于核酸染色；是一种强的诱变剂，可能也是一种致癌物或致畸剂。

EB与核酸的作用原理：这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出橙红色萤光。

在与DNA或双股RNA结合时，萤光强度会增强20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的相对位置。

在核酸分子中，EB分子插入到两层碱基对之间，发出红色荧光。

在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。

问题讨论1、溴化乙锭EB在琼脂糖凝胶电泳中先加与后加的区别？先加EB，染色与电泳同时进行：a. 加在胶里总体积小，所以比较方便节省；b. 会导致胶的整体背景稍微高些，比较暗；c. 长时间、长距离的电泳先加EB的话，信号强度会相应下降；d. 不宜用于核酸分子大小的确定和定量。

原因分析：EB带正电荷，中和核酸分子的负电荷，同时由于的他的嵌入增加了核酸分子的刚性，使迁移速率减慢，故不宜用于凝胶电泳测定核酸分子的大小。

另外，由于在凝胶中，游离的EB分子向负极泳动，会使样品中前后各带染色不均匀，影响定量。

后加EB，染色在电泳完成后：a．可以减少污染，无背景色，图较漂亮；b. 相对浪费时间。

2、EB废物的如何处理？EB废物的处理如下：(1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时；c. 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。

(2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理：a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。