细胞自噬预实验

细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)产品简介：碧云天生产的细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，即Autophagy Staining Assay Kit with MDC ，是一种使用丹酰尸胺，也称单丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)作为荧光探针快速便捷地检测细胞自噬的试剂盒。

自噬(autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。

自噬与多种生理功能有关，在饥饿等环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。

自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。

由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个研究热点。

MDC 是细胞自噬检测最常用的荧光探针之一。

MDC 可以通过离子捕获(ion trapping)和与膜脂的特异性结合，从而特异性标记自噬体(autophagosome)，也称autophagic vacuole ，因而常用于细胞自噬的检测。

MDC 是一种嗜酸性荧光探针，很多酸性膜性结构也会被MDC 染色，因此MDC 染色时正常的细胞也会有一定的染色背景。

本产品的染色原理决定了本产品只能用于培养的细胞或者组织的细胞自噬荧光染色检测，不能用于冻存的或固定的细胞、组织或者组织切片的染色检测。

使用本产品染色后可以通过荧光显微镜拍照观察，也可以通过荧光酶标仪或流式细胞仪进行荧光检测。

荧光显微镜观察时可以使用紫外区激发光激发，发出绿色荧光。

荧光酶标仪或流式细胞仪推荐的激发波长为335nm (330-360nm 均可)，发射波长为512nm (510-540nm 均可)。

本产品用于细胞自噬染色的效果参考图1。

图1. 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)的染色效果图。

自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南1自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating ）”的现象，凋亡是“自 杀（Self-killing ）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白， 但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指 膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包 裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与 溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳 态和细胞器的更新。

目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略 和手段有：通过western blot 检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体 的形成；在荧光显微镜下采用GFP （-RFP ）-LC3等融合蛋白来示踪自 噬体形成以及降解。

近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们 汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流) 的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指 示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对 酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检 测到红色荧光。

这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了 细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利 器。

mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。

（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。

2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。

建议不要在-20℃下长期保存。

如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。

MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。

临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。

EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。

另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。

24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。

我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。

线粒体自噬操作指南汉恒生物科技（上海）有限公司目录背景 (1)一、汉恒线粒体自噬表型研究工具 (1)二、汉恒线粒体自噬通路研究工具 (2)⏹病毒安全使用注意事项 (3)⏹收到病毒后的处理 (3)腺病毒的操作 (5)⏹腺病毒感染细胞预实验（MOI的摸索） (5)⏹感染目的细胞 (7)（一）细胞准备 (7)（二）病毒感染 (7)（三）观察感染情况 (8)（四）结果分析 (8)背景自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新线粒体自噬是细胞在应对氧化应激等压力条件下一种基本的生物学现象，细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。

选择性清除受损伤或功能不完整的线粒体对于整个线粒体网络的功能完整性和细胞生存来说十分关键。

一、汉恒线粒体自噬表型研究工具我们用自噬小体单标工具LC3-GFP标记自噬小体，用mito-RFP标记线粒体。

GFP-LC3和RFP-LC3等单标记的荧光探针可以监测LC3蛋白参与自噬起始过程。

mito-RFP线粒体特异性定位荧光探针（pHBmTur-Mito）可准确标记定位线粒体，两者共转染细胞即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程。

除此外，我们研发了专用于线粒体自噬的mt-keima，可独立应用于线粒体自噬的研究，mt-keima所表达的 Keima 蛋白定位于线粒体基质, 当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima 蛋白的荧光信号由绿色转为红色，荧光信号的转换可定量反映线粒体自噬的发生发展，是我们研究线粒体自噬不可或缺的利器相关产品列表：产品名称融合标签产品规格HBAD-GFP-LC3GFP1x10^10PFU/mlHBAD-GFP-LC3GFP1x10^11PFU/mlHBAD-mito-dsred Dsred1x10^10PFU/mlHBAD-mito-dsred Dsred1x10^11PFU/mlHBAD-mkeima Keima1x10^10PFU/mlHBAD-mkeima Keima1x10^11PFU/ml备注：汉恒生物同时提供相关基因慢病毒和腺相关病毒包装服务，满足广大科研工作者不同实验需求，如使用慢病毒和腺相关病毒产品，具体操作参考相应技术文档。

自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。

目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。

近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。

（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。

2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。

建议不要在-20℃下长期保存。

如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。

3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。

自噬流的检测方法一、本文概述自噬流是一种细胞自我消化和再生的过程，对于维持细胞稳态和适应环境变化具有重要意义。

随着生物学研究的深入，自噬流的检测已成为研究细胞自噬机制的重要手段。

本文旨在综述自噬流的检测方法，包括常用的生物化学方法、显微成像技术以及基于流式细胞仪的分析等。

我们将详细介绍这些方法的原理、操作步骤、优缺点以及应用实例，以期为自噬流研究提供全面的技术支持和参考。

通过本文的阅读，读者可以深入了解自噬流检测的原理和方法，掌握自噬流研究的最新进展，为相关研究提供有益的借鉴和指导。

二、自噬流的基本概念和机制自噬流（Autophagic Flux）是细胞自噬过程的一个核心概念，它描述了从自噬体的形成、自噬底物的降解，到降解产物的再利用这一连续过程。

自噬是一种细胞内的降解途径，通过这一过程，细胞可以将受损的细胞器、错误折叠的蛋白质或其他细胞内组分包裹在双层膜结构的自噬体中，并运送到溶酶体进行降解，从而实现物质的循环利用和细胞的稳态维持。

自噬流的基本机制涉及多个关键步骤。

细胞在感受到饥饿、缺氧或其他压力信号时，会启动自噬过程。

随后，自噬相关基因（Autophagy-related genes, ATGs）及其产物会参与自噬体的形成。

这些自噬体通过膜延伸和闭合，将待降解的底物包裹在内。

形成成熟的自噬体后，它们会与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。

在自噬溶酶体中，自噬体的内膜及其包裹的底物会被溶酶体中的水解酶降解，释放出氨基酸、脂肪酸等小分子物质。

这些降解产物随后会被细胞重新利用，以支持细胞的生存和代谢活动。

自噬流的顺畅进行对于细胞的正常生理功能至关重要。

它不仅可以清除细胞内的有害物质和受损组分，还可以为细胞提供能量和营养物质，以应对各种环境压力。

因此，研究自噬流的检测方法对于理解自噬的生理和病理作用，以及开发相关疾病的治疗策略具有重要意义。

三、自噬流检测方法的分类与特点自噬流的检测是理解自噬过程的关键环节，其方法多种多样，各具特点。

透射电子显微镜观察细胞自噬的具体步骤及详细方法技术简介透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是使用最为广泛的一类电镜。

通过发射电子束从而穿过超薄的样品，同时与样本相互作用，既而形成图像。

透射电镜具有分辨率高和放大倍数高的优点。

其分辨率为0.1-0.2nm，放大倍数为几万到几十万倍。

目前透射电镜已经广泛的应用到癌症研究，病毒学研究，微生物学，细胞学研究等生物领域。

透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。

电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。

散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。

由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备超薄切片(通常为50-100 nm)。

要在机体死亡后的数分钟内取材，组织块要小(1mm3以内)，常用戊二醛和锇酸双重固定，包埋介质包埋，用超薄切片机切成薄片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。

自噬体是自噬的标志性结构。

自噬体属于亚细胞结构，直径一般为300～900nm，平均500nm，普通光镜下看不到。

通过透射电子显微镜发现自噬体一直是观察自噬现象最直接、最经典的方法，是自噬检测的“金标准”。

二、实验流程透射电镜生物样品制备步骤：1. 固定：用2.5%的戊二醛固定2小时。

2. 锇酸固定：用2%的锇酸固定2小时。

3. 脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min(70%乙醇中过夜)，再用100%乙醇脱水3次，每次20min。

4. 置换：用丙酮置换2次，每次15min。

5. 浸渍：a．丙酮：包埋剂=1：2的浸渍液浸渍4h；b. 纯包埋剂浸渍2次，每次4h。

6. 包埋：将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中。

7. 聚合：将包埋板置于65℃条件下各聚合48h以上。

8. 修块：将包埋头修成梯形，且样品表面积小于0.2mm×0.2mm。

细胞自噬过程及临床应用展望细胞自噬（autophagy）是一种重要的细胞生物学过程，通过将细胞内的有害物质、受损蛋白或细胞器包裹进独特的囊泡（自噬体）中，然后通过与溶酶体融合并降解这些物质的方式，实现细胞清除和再利用的过程。

细胞自噬在维持细胞内环境稳定、抗衰老、抗癌以及调节免疫应答等方面发挥着重要作用。

最近的研究进展表明，细胞自噬还具有潜在的临床应用前景，在促进治疗药物的研发以及治疗许多与老年病相关的疾病方面具有潜力。

细胞自噬的过程通常可以分为三个主要步骤：包裹、运输和降解。

首先，通过膜结构的特殊复合物形成，细胞内的有害物质或细胞器被包裹在称为自噬体的囊泡中。

这些自噬体随后被转运至溶酶体，然后与溶酶体膜融合，形成自噬体溶酶体复合体。

最后，在自噬体溶酶体复合体中，有害物质被酶降解并分解成可再利用的基本分子，并通过自噬体溶酶体膜通过逆向运输返回到细胞质中进行再利用。

在细胞自噬的过程中，一些关键分子和信号通路起着重要作用。

微管相关蛋白1A/1B轻链3（microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3, LC3）是自噬过程中重要的标志物，参与了包裹和运输步骤，被广泛用于研究细胞自噬。

自曝7p/cm-镰刀硷赋恁殖勐格揪?降解的最终产物。

另外，以mTOR （mammalian target of rapamycin）为核心的信号通路在细胞自噬的调节中起着重要的作用。

当细胞受到应激或营养不足时，mTOR信号通路会被抑制，从而促进自噬的启动。

细胞自噬在许多疾病的发生发展中发挥着重要作用。

研究发现，细胞自噬在保护细胞免受氧化应激和蛋白质聚集等损伤时具有保护作用，可能在癌症的预防和治疗中发挥着重要作用。

一些化疗药物和免疫治疗手段已经被发现可以通过促进细胞自噬来增强对癌细胞的杀伤作用。

此外，细胞自噬还与多种老年病和神经退行性疾病的发生发展有关。

例如，阿尔茨海默病、帕金森病和亚历山大症等疾病都存在细胞自噬缺陷的现象。

线粒体自噬实验研究步骤一、实验准备1. 实验设备：显微镜、细胞培养箱、离心机、PCR仪、电泳设备等。

2. 实验试剂：DMEM培养基、胎牛血清、PBS缓冲液、线粒体自噬相关抗体、荧光标记二抗、细胞凋亡检测试剂盒等。

二、细胞处理1. 细胞传代：将细胞从培养瓶中吹散，加入适量培养基，离心后重新悬浮于培养基中，接种到培养皿或培养瓶中，放入细胞培养箱中进行培养。

2. 细胞同步化：为了使实验结果更加准确，需要对细胞进行同步化处理。

常用的方法包括饥饿法、血清法等。

3. 药物处理：根据实验设计，向细胞中加入相应的药物或抑制剂，处理一定时间后，收集细胞样本进行下一步实验。

三、样本制备1. 细胞爬片：将细胞接种到涂有抗凝剂的载玻片上，培养一定时间后进行固定。

2. 细胞染色：采用荧光染色或免疫组化染色等方法，对细胞进行标记和染色。

3. 制作切片：将染色后的细胞进行切片，制备成临时装片或石蜡切片。

四、显微观察1. 荧光显微镜观察：利用荧光显微镜观察荧光染色标记的细胞样本，观察线粒体自噬的情况。

2. 倒置显微镜观察：利用倒置显微镜观察细胞的生长状态和形态变化。

3. 激光共聚焦显微镜观察：利用激光共聚焦显微镜观察细胞的荧光信号和定位情况。

五、数据分析1. 图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察到的图像进行分析，测量线粒体自噬的相关参数，如自噬体数量、大小等。

2. 定量分析：采用定量PCR、Western blot等方法对实验数据进行定量分析，比较不同处理组之间的差异。

3. 统计分析：采用统计软件对实验数据进行统计分析，计算相关指标和参数，比较不同处理组之间的差异显著性。

六、结果解读根据实验结果，分析线粒体自噬在相关生理或病理过程中的作用和机制，探讨其与疾病的关系，为进一步的研究和应用提供理论依据。

七、实验总结根据实验结果和数据分析，总结实验结论，评估实验的优缺点，提出改进意见和建议，为后续的研究和应用提供参考和借鉴。