β地中海贫血基因检测怎么做

专利名称：人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法专利类型：发明专利
发明人：胡晓艳,钟宇萍,吴宇亮,李科铮
申请号：CN201811531566.1
申请日：20181214
公开号：CN111321211A
公开日：
20200623
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及基因检测技术领域，具体提供一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法。

该试剂包括：分别针对β、β、β、β、β、β基因位点的第一、第二、第三、第四、第五、第六对引物；第一、第二、第三、第四、第五、第六单位点探针。

本发明的试剂检测结合率高、通量大而且检测成本低。

申请人：北京大学深圳医院,深圳鼎新融合科技有限公司
地址：518000 广东省深圳市福田区莲花路1120号
国籍：CN
代理机构：深圳中一联合知识产权代理有限公司
代理人：张全文
更多信息请下载全文后查看。

地中海贫血检测的方法目前,用于地中海贫血检测的方法的代表性技术大体可分为以下两类:检测基因缺失突变的单管多重跨越断裂点PCR技术和多重连接探针扩增技术(MLPA);检测基因点突变的反向点杂交技术(RDB)、变性高效液相色谱技术(dHPLC)]和DNA序列分析技术等。

此外,最近发展的基于实时荧光PCR平台的新技术,如用于α地贫缺失拷贝数定量的实时荧光PCR直接检测技术、以及用于检测β地贫点突变的基于探针熔解曲线的基因分型技术(PMCA),可能是下一步更新换代的技术选择。

上述胛p PCR、RDB和MLPA等为地贫检测的主流技术。

1.Southern 印迹法优点：分析缺失型α-地中海贫血分子缺陷的可靠技术缺点：操作繁冗，不宜作为常规手段2.联合检测平均红细胞参数（MCV、MCH）+红细胞脆性检测+Hb（血红蛋白）电泳MCV：平均红细胞容积 MCH：平均红细胞血红蛋白量3.PCR-RDB法（PCR/寡核苷酸探针反向斑点杂交法）检测中国南方常见的17种β地贫突变：CD41～42(-TCCT)、IVS-2 nt654 C →T、-28 A→G、CD71～72（+A）、CD71～72（+T）、CD17 A→T、CD26 G→A、CD31（-C）、CD27～28（+C）、CD43 G→T、-32 C→A、-29 A→G、-30 T→C、CD14～15（+G）、CAP、Int及IVS-1 nt5 G→C4.α地中海贫血的基因诊断依据Gap-PCR原理采用单管四重PCR法（多重PCR技术）对其基因组DNA进行扩增，同时检测-α3.7、-α4.2、--SEA和正常对照4种等位基因型，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，通过片断大小判断患者的基因型。

5.采用PCR-RFLP方法检测非缺失型α地贫Hb Constant Spring(HbCS)。

遗传性β地中海贫血病ＣＤ17点突变的快速简便检测摘要：利用聚合酶延伸技术及双链特异性嵌入染料的特性，建立了一种快速简便的基因点突变的检测方法，在特定引物聚合过程中，不同基因型的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光信号的变化实现基因点突变的快速检测，不需要复杂的凝胶电泳、荧光和同位素标记等操作，通过对β珠蛋白基因CD17点突变的检测，证实该方法是一种廉价、简便、快速的筛查遗传性地中海贫血病β珠蛋白基因CD17点突变的方法，该方法可扩展到各种基因的点突变检测。

关键词：点突变；聚合酶；遗传性地中海贫血病；基因突变筛查β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(α2β2)的卢珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成α与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病，若胎儿同时接受来自父母的两个β地贫基因，则为突变纯合子，绝大多数表现为重型β地贫疾病，目前尚无有效疗法，这些病人往往幼年夭折或靠输血维持生命，通过基因检测预防地贫患儿的出生是控制该遗传病的可行方法。

β-地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白基因的CDl7(A→T)点突变是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一，β地贫基因突变的传统检测方法是以凝胶电泳为基础的方法。

操作繁琐复杂，费时长，目前常用的诊断方法是聚合酶链反应结合斑点杂交技术，该方法准确性高，但需要放射性同位素标记和繁琐的分子杂交技术：Pun等报道了一种变性高效液相色谱基因分型新技术，无需放射性同位素标记，但这种方法操作复杂，仪器昂贵，实验周期长；新发展起来的实时荧光PCR技术已用于遗传性血色病HFE基因点突变检测，操作简便，但探针的设计难度和检测仪器成本较高，限制其广泛应用，利用双链结合染料嵌入双链DNA发出荧光的原理，我们建立了一种在常温下实时检测聚合酶活性的简便方法，本文在此基础上，基于聚合酶延伸技术和双链特异性嵌入染料特性，发展了一种快速简便的点突变实时检测方法，该方法通过染料的嵌入和荧光信号的变化实现点突变检测，不需昂贵仪器，也不需复杂的凝胶电泳操作和标记等过程，操作方便、简单，利用该方法，对β地贫疾病相关的CD17突变进行了检测，该方法为基因点突变及单核苷酸多态性的检测提供了一个快速简捷的有效方法，为药物筛选、疾病防治和单倍型计划提供一种新的手段和思路。

某医院检验科作业指导书WORK INSTRUCTOR标题：β-地中海贫血基因检测标准操作规程β-地中海贫血基因检测标准操作规程1原理采用PCR 体外扩增和DNA 反向点杂交相结合的DNA 芯片技术：。

2器材2.1 试剂2.1.1 全血基因组提取试剂：深圳亚能全血DNA 快速提取试剂盒（25人份/盒）。

有效期：1年。

2.1.2 亚能β-地中海贫血基因诊断试剂盒（25人份/盒）。

主要组成： 储存条件：试剂盒Ⅰ保存在﹣18℃以下；试剂盒Ⅱ保存在2～8℃。

有效期：6个月。

2.1.3 自备试剂：2.1.3.1 20×SSC （pH 7.0）NaCl 175.3g 柠檬酸钠 88.2g加蒸馏水 750mL 溶解，用pH 计调pH 至7.0，最后定容至1000mL ，并高压灭菌保存。

试剂盒ⅠPCR 反应液 25管 23L试剂盒Ⅱ膜条 25张 POD 母液1管 75L TMB 1瓶 10mL 矿物油 1管 1mL 30％ H 2O 21管75L2.1.3.210% SDS（pH 7.0）SDS 20g加蒸馏水 180mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至200mL。

2.1.3.31M柠檬酸钠（pH 5.0）柠檬酸钠294g加蒸馏水 700mL溶解，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至1000mL。

2.1.3.4A液（2×SSC，0.1%SDS， pH 7.4）20×SSC 100mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.5B液（0.5×SSC，0.1%SDS， pH 7.4）20×SSC 25mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.6C液（0.1M柠檬酸钠，pH 5.4）1M柠檬酸钠 100mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.7显色液（新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液）C液 19 mLTMB 1 mL30% H2O2 2μL2.2仪器某公司某型移液器某公司某型离心机某公司某型生物安全柜某公司某型PCR仪某公司某型水浴锅某公司某型分子杂交仪某公司某型水平摇床某公司某型扫描仪3操作规程3.1DNA提取3.1.1在1.5mL离心管中加入800L裂红液及100L抗凝全血，充分混匀，室温放置2～3min，8000rpm离心2分钟，弃去上清，小心保留管底沉淀。

地中海贫血基因检测实验步骤地中海贫血（Mediterranean anemia），又称为地中海型家族性小红细胞性贫血，是一种常染色体隐性遗传病。

该病是由珠蛋白基因缺陷引起的，导致血红蛋白结构异常，造成红细胞携氧能力减弱。

地中海贫血的基因检测通常涉及以下几个步骤：1. 样本采集：- 采集患者的血液样本或使用拭子采集口腔黏膜细胞。

2. DNA提取：- 从血液或细胞样本中提取DNA。

这通常涉及破坏细胞膜和核膜，然后使用化学试剂纯化DNA。

3. PCR扩增：- 利用聚合酶链反应（PCR）技术，特异性地扩增珠蛋白基因的特定片段。

这通常涉及设计针对基因突变热点区域的引物，并通过循环加热和退火步骤使目标DNA片段指数级增长。

4. 凝胶电泳：- 将PCR产物通过凝胶电泳进行分离，根据大小将不同长度的DNA片段分开。

这有助于识别是否存在特定的突变。

5. 基因测序：- 对PCR产物进行测序，以识别可能的基因突变。

测序可以揭示DNA序列中的碱基替换、插入或缺失，这些改变可能与地中海贫血的发生有关。

6. 突变分析：- 将测序结果与已知的突变数据库进行比对，以确定是否存在与地中海贫血相关的特定基因突变。

7. 数据解读：- 根据突变分析的结果，结合患者的临床症状和家族史，医生或遗传顾问将解释检测结果，并提供遗传咨询服务。

8. 报告编写：- 编写一份包含检测结果和相关解释的报告，供医疗专业人员和患者参考。

基因检测对于诊断地中海贫血非常重要，它不仅可以帮助确诊患有该病的个体，还可以为家族成员提供风险评估和遗传咨询。

随着科技的进步，新的检测技术（如芯片基因分型和下一代测序）正在使地中海贫血的基因检测变得更加快速和精确。

β-地中海贫血基因检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名称:β-地中海贫血基因检测试剂盒（荧光PCR法）【包装规格】24人份/盒【预期用途】本试剂盒用于定性检测β-地中海贫血基因突变情况，以EDTA抗凝全血为检测样本，适用于临床β-地中海贫血基因突变的诊断。

β-地中海贫血是一组遗传性疾病，其临床表现多样，由轻到重，甚至危及生命，导致患者在未成年即夭折甚至胎死腹中，给家庭和社会带来巨大的负担。

且目前尚无根治手段，国内外都没有疗效标准。

因此控制和降低β-地中海贫血患儿的出生率才能有效地监控该病的发生，通过人群筛查和遗传咨询，对有携带β地贫基因的孕龄夫妇所孕胎儿实施产前诊断，是目前最有效的控制重症β-地中海贫血患儿出生的方法。

【检验原理】本试剂盒能够检测24种β-地中海贫血基因类型（具体信息见附表1），采用八联PCR管进行检测，12管一人份，共12支扩增液（扩增液检测突变类型及对应的荧光通道信息详见附表2），每个反应管检测两种突变型和两种野生型，分别通过四个不同的荧光通道读取信息。

根据文献，我们参照人类β-地中海贫血基因情况以包括突变情况的一段基因序列作为靶序列，设计特异性突变检测引物探针、特异性野生型检测引物探针，采用基因扩增技术对核酸特异性基因进行检测。

突变型情况由FAM、HEX指示，野生型情况由ROX、CY5指示，对β-地中海贫血基因进行特异性检测，为临床检验提供实验室辅助诊断的依据。

本试剂盒使用核酸提取试剂提取基因组DNA。

试剂盒添加了防污染成分UNG酶，UNG酶可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增，保证扩增结果的特异性，准确性。

【主要组成成分】试剂盒1：编号扩增液类型规格数量引物探针类型1 β地贫1 扩增液24人份/支1支41-42M引物探针，IVS-Ⅱ-5M引物探针2 β地贫2扩增液24人份/支1支654M引物探针，43M引物探针3 β地贫3扩增液24人份/支1支26M引物探针，30M引物探针4 β地贫4扩增液24人份/支1支27-28M引物探针，IVS-1-1M(T)引物探针5 β地贫5扩增液24人份/支1支31M引物探针，-28M引物探针6 β地贫6扩增液24人份/支1支17M引物探针，-29M引物探针7 β地贫7扩增液24人份/支1支IVS-1-1M(A)引物探针，71-72M（A）引物探针8 β地贫8扩增液24人份/支1支14-15M引物探针，41M引物探针9 β地贫9扩增液24人份/支1支IVS-1-5M引物探针，71-72M（T）引物探针10 β地贫10扩增液24人份/支1支-31M引物探针，CAP40-43M引物探针11 β地贫11扩增液24人份/支1支IntM引物探针，-32M引物探针12 β地贫12扩增液24人份/支1支CAP-1M引物探针，-30M引物探针组成成分生化组成规格数量H-2应缓冲液4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钾、氯化镁、硫酸铵、甲酰胺、脱氧核糖核苷三磷酸1.5mL/支4支A酶混合液Taq DNA聚合酶、尿嘧啶糖基化酶、酶储存液A 50μL /支3支稀释缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、三羟甲基氨基甲烷 1.5mL/支6支TE缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠盐1.5mL/支2支石蜡油 1.5mL/支5支试剂盒2：组成成分生化组成规格数量β地贫阴性对照生理盐水500μL/支1支β地贫阳性对照质粒500μL/支1支注：本试剂盒由试剂盒1和试剂盒2组成。

α-地中海贫血基因诊断项目开展指南一α-地中海贫血基因诊断流程示意图二实验室建设1最佳α-地中海贫血基因诊断实验室设计平面图1）实验室应具有试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区及产物分析区（如上图）2）临床样本的收取及储存应该在这4个区域以外的地方完成。

3）进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序。

4）进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的工作服，并同时佩戴一次性手套。

出工作区之前必须脱去区域特定工作服及手套。

5）每一个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材（包括移液器、离心机、试管架、一次性手套、移液吸头、离心管及冰箱等），且不同区域的仪器设备及耗材不能混用。

2实验室环境1）工作区域必须始终保持清洁整齐2）所有实验台面及地面均应保持清洁.3）所有实验废料及垃圾使用专用垃圾袋装好后，封口处理。

4）每次工作前后对工作台面进行消毒液擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯进行灭菌。

3 实验室制度及人员配备1）实验室必须有完整详细的操作规章制度并严格遵守。

2）操作人员需要一定的专业技术知识和经验。

3）操作人员需要有强烈的责任感，且工作认真细心。

4）操作人员需要严格遵守α-地贫基因诊断的操作规程。

三实验所需试剂、设备及其功能简介α-地中海贫血基因诊断实验主要由以下三个实验组成：全血或羊水 DNA的抽提，基因扩增（PCR），电泳分析。

1 实验所需试剂2 实验所需仪器（推荐使用）及功能简介β-地中海贫血基因诊断项目开展指南一β－地中海贫血基因诊断实验工作流程二实验室建设1最佳β-地中海贫血基因诊断实验室设计平面图1）实验室应具有试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区及产物分析区（如上图）2）临床样本的收取及储存应该在这4个区域以外的地方完成。

3）进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序。

4）进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的工作服，并同时佩戴一次性手套,出工作区之前必须脱去区域特定工作服及手套。

第1篇一、实验背景地中海贫血（Thalassemia）是一种由于珠蛋白基因缺陷引起的遗传性溶血性贫血病。

根据珠蛋白基因突变的不同，地中海贫血可分为α-地中海贫血和β-地中海贫血两大类。

本实验旨在通过分子生物学技术对疑似地中海贫血患者进行基因检测，以确定其基因型，为临床诊断和治疗提供依据。

二、实验目的1. 确定疑似地中海贫血患者的基因型。

2. 为临床诊断和治疗提供科学依据。

三、实验材料1. 样本：疑似地中海贫血患者的血液样本。

2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA测序试剂盒等。

3. 仪器：PCR仪、电泳仪、测序仪等。

四、实验方法1. 样本DNA提取：采用DNA提取试剂盒提取疑似地中海贫血患者的血液样本DNA。

2. PCR扩增：根据α-地中海贫血和β-地中海贫血的基因突变位点，设计特异性引物，进行PCR扩增。

3. PCR产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察条带情况。

4. DNA测序：对扩增产物进行DNA测序，确定基因突变位点。

5. 基因型分析：根据测序结果，分析疑似地中海贫血患者的基因型。

五、实验结果1. 样本DNA提取：成功提取疑似地中海贫血患者的血液样本DNA。

2. PCR扩增：成功扩增出α-地中海贫血和β-地中海贫血的基因片段。

3. PCR产物检测：电泳结果显示，扩增产物大小与预期相符。

4. DNA测序：测序结果显示，疑似地中海贫血患者的基因存在突变。

5. 基因型分析：根据测序结果，确定疑似地中海贫血患者的基因型为α-地中海贫血杂合子。

六、讨论与分析1. α-地中海贫血是一种常染色体隐性遗传病，主要由于α-珠蛋白基因缺陷引起。

本实验通过PCR和DNA测序技术，成功检测出疑似地中海贫血患者的基因突变，为临床诊断提供了依据。

2. α-地中海贫血的基因型可分为纯合子和杂合子。

本实验结果显示，疑似地中海贫血患者的基因型为α-地中海贫血杂合子，提示其可能表现为轻型α-地中海贫血或无症状携带者。

有关“地贫基因”的筛查流程
有关“地贫基因”的筛查流程如下：
1.初步筛查：通常通过血常规检查进行初步筛查，观察红细胞指标以及血红蛋白电泳等
指标，对于异常者进行下一步的地贫基因检测。

2.基因检测：在孕前或孕早期，通过基因检测技术明确α、β珠蛋白基因的异常位点，
为产前诊断做准备。

基因检测包括肽链检测和基因分析。

3.产前诊断：对于有高危因素的孕妇，例如夫妇双方为地贫基因携带者，或者在有地贫
高发的地区，进行产前诊断。

对孕11-14周孕妇取绒毛组织约2-5g，孕15-22周孕妇经羊膜穿刺抽取羊水15-20ml，24-30周孕妇抽取胎儿脐带血0.5-1.5ml，通过基因检测明确胎儿有无α或β珠蛋白基因的缺失或突变以及类型。

4.遗传咨询：根据产前诊断结果，对夫妇进行遗传咨询，预测胎儿成为中型或重型地贫
患者的机会，并告知下一代的遗传风险。

5.终止妊娠：对于重型地贫胎儿，医生可能会建议终止妊娠。

地中海贫血基因检测步骤有多少个？地中海贫血是由于珠蛋白肽链基因突变或缺失而导致的遗传性溶血性贫血，所以又叫做珠蛋白生成障碍性贫血。

广东和广西的地中海贫血在我国发生率分别为10％及20％，病例数更是占了全国总数的五分之二以上，可见存在家族遗传病史且处于高风险地区的朋友，建议进行基因检测来提前预防，那地中海贫血基因检测步骤到底有哪些呢？1. 调查家庭病史实际上并不是所有人都一定需要进行基因检查，因此地中海贫血基因检测步骤的第一步，就是要先调查一下个人的家庭病史，这是由于地中海贫血是遗传性疾病，所以如果家庭成员当中没有地中海贫血患者的话，那么一般不会直接考虑相关的基因检测，只需平时定时做好身体检查即可。

2. 挑选检测机构假如经过调查后发现家族当中确实存在地中海贫血病史，那么就得马上引起重视，除了自己要预约相关的地中海贫血基因检测以外，还需要在日后搭配孕前诊断和产前筛查，以防基因遗传给下一代，所以地中海贫血基因检测步骤的第二个重要环节，就是要找到正规优质的基因检测机构，比如近几年在业内口碑评价极佳的香港中环专科，如有需要可以在中环专科官网或v信（tchchk）预约。

3. 预约检查项目找到合适的基因检测机构之后，接下来地中海贫血基因检测步骤的步骤则是要预约对应的项目，香港中环专科的地中海贫血基因筛查，它采用了全新的第三代测序技术，涵盖了637种基因变异，是目前市面上最全面的地中海贫血基因筛查技术。

4. 根据指引检测最后一个地中海贫血基因检测步骤，无疑就是在达到体检机构之后，根据指引完成整个检测过程，这其实并没有太大的难度，但是需要注意一些检查前的特别事项，因为采集样本的方式通常是抽取血液或羊水，所以在饮食和生活方面得多加留意。

地中海贫血基因检测步骤一般就是以上的四个步骤，考虑到地中海贫血属于遗传性疾病，所以如果家族成员当中存在该病例，那么都建议尽快到香港中环专科的官方网站预约。

当然，任何计划怀孕或有疑似症状的朋友也可以配合筛查，以达到早发现早干预的效果。

某医院检验科作业指导书WORK INSTRUCTOR标题：β-地中海贫血基因检测标准操作规程β-地中海贫血基因检测标准操作规程1原理采用PCR 体外扩增和DNA 反向点杂交相结合的DNA 芯片技术：。

2器材2.1 试剂2.1.1 全血基因组提取试剂：深圳亚能全血DNA 快速提取试剂盒（25人份/盒）。

有效期：1年。

2.1.2 亚能β-地中海贫血基因诊断试剂盒（25人份/盒）。

主要组成： 储存条件：试剂盒Ⅰ保存在﹣18℃以下；试剂盒Ⅱ保存在2～8℃。

有效期：6个月。

2.1.3 自备试剂：2.1.3.1 20×SSC （pH 7.0）NaCl 175.3g组成成分 数量 规格 试剂盒ⅠPCR 反应液 25管 23μL 试剂盒Ⅱ膜条 25张 POD 母液1管 75μL TMB 1瓶 10mL 矿物油 1管 1mL 30％ H 2O 21管75μL柠檬酸钠88.2g加蒸馏水750mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至1000mL，并高压灭菌保存。

2.1.3.210% SDS（pH 7.0）SDS 20g加蒸馏水180mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至200mL。

2.1.3.31M柠檬酸钠（pH 5.0）柠檬酸钠294g加蒸馏水700mL溶解，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至1000mL。

2.1.3.4A液（2×SSC，0.1%SDS，pH 7.4）20×SSC 100mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.5B液（0.5×SSC，0.1%SDS，pH 7.4）20×SSC 25mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.6C液（0.1M柠檬酸钠，pH 5.4）1M柠檬酸钠100mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.7显色液（新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液）C液19 mLTMB 1 mL30% H2O22μL2.2仪器某公司某型移液器某公司某型离心机某公司某型生物安全柜某公司某型PCR仪某公司某型水浴锅某公司某型分子杂交仪某公司某型水平摇床某公司某型扫描仪3操作规程3.1DNA提取3.1.1在1.5mL离心管中加入800μL裂红液及100μL抗凝全血，充分混匀，室温放置2～3min，8000rpm离心2分钟，弃去上清，小心保留管底沉淀。