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β地中海贫血基因检测反向点杂交法ppt课件

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小儿β地中海贫血的科普知识PPT

小儿β地中海贫血的科普知识PPT

如何提高患者生活质量
预防感染：避免接触传染疾病 的病例等。 定期检查：定期进行相关检查 ，如贫血指数等。
小结
小结
介绍：小结本次科普内容，对小儿β地 中海贫血的预防、诊断和治疗进行总结 。
建议：科学预防小儿β地中海贫血是重 要的，建议广大家庭对个人的基因状况 进行检测和分析。
谢谢您的观赏聆听
病因：由于基因突变导致体内 血红蛋白合成异常，从而导致 贫血。
什么是小儿β地中海贫血 ？
症状：病儿常常出现贫血、黄疸、肝脾 大等症状。
小儿β地中海 贫血的遗传方
式
小儿β地中海贫血的遗传 方式
介绍：小儿β地中海贫血是一 种常见的遗传性疾病，主要由 父母遗传给孩子。
遗传方式：小儿β地中海贫血 是由遗传了缺陷β-地中海贫血 基因的父母给孩子遗传的。
小儿β地中海 贫血的科普知
识PPT
目录 什么是小儿β地中海贫血？ 小儿β地中海贫血的遗传方式 小儿β地中海贫血的诊断和治 疗 小儿β地中海贫血的预防 如何提高患者生活质量 小结
什么是小儿β 地中海贫血？
什么是小儿β地中海贫血 ？
介绍：小儿β地中海贫血是一 种常见的遗传性疾病，主要影 响红细胞的生成和预防顾及到基因和生 殖选择等多方面问题。 父母预防：建立完整家族病史，进行基 因检测，进行生殖咨询等。
小儿β地中海贫血的预防
孩子预防：定期进行相关检查 ，避免药物滥用等。
如何提高患者 生活质量
如何提高患者生活质量
介绍：小儿β地中海贫血是一种慢性疾 病，因此患者需要改善生活习惯，提高 生活质量。 增强体质：保持良好的饮食习惯，多进 行适当的运动等。
小儿β地中海 贫血的诊断和
治疗
小儿β地中海贫血的诊断 和治疗

β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法课件

β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法课件

35cycles
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
4.洗膜 ： 50ml塑料管
B液 40ml
42预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进 行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩 增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的 拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循 环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际 反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序 列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐 积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种 效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的 种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数 情况下，平台期的到来是不可避免的。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环 的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。

地中海贫血基因检测的临床应用PPT课件

地中海贫血基因检测的临床应用PPT课件
a2a1T< a2- < - a1<a2Ta1< -a1T < - -
地贫的基因型与表现型
• 重型-地中海贫血 ＋/ ＋、0/ 0 、0/ ＋ 所有患者有组织缺氧症状，可出现“地中海 （纯合子或双重杂合子） 贫血面容”，生长发育迟缓。红细胞体积小
且低色素。过剩的游离α链形成α链包涵体， 引起溶血性贫血，靠输血维持生命。
地中海贫血基因检测 在临床诊断上的应用
地中海贫血
• 地中海贫血，又称海洋性贫血，是一种常见的单 基因遗传性溶血性血液疾病。
• 广泛分布在全世界沿海地区。 • 中国常见于东南沿海、西南
地区以及台湾地区。
地中海贫血的分布
地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一
地中海贫血
地中海贫血的共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使 血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或 不能合成，致使血红蛋白的组成成分改变。
CD 17 (A→T)
CDs 71-72 (+A) CD 43 (G→T) -29 (A→G) CDs 27-28 (+A) -gene deletion 未知突变
等位基因数
198 72 49 33 10
8
7 7 4 4 1 3
频率(%)
2.54 0.92 0.63 0.42 0.13
0.10
0.09 0.09 0.05 0.05 0.01 0.04
• 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等
-地中海贫血突变类型
• 编码区的移码突变、无义突变和起始密码突变：
如CD41-42，CD71-72 ，CD17突变后形成终止子，表 现为0。

地中海贫血诊断检查ppt课件

地中海贫血诊断检查ppt课件

*
地贫筛查后哪些情况 需做地贫基因检测？
1.Hb正常或轻度下降，MCV下降和 （或）MCH下降，但电泳没有阳性 发现的（HbA2检测误差，轻型或静 止型α 地贫 ），要做地贫基因检 测。 2.夫妇双方一方确定为α （β ）地 贫 ，另一方做地贫基因。
地贫的基因分析局限性
1.由于分子诊断技术本身的局限性， 地贫基因诊断的误诊及漏诊率约2%。
诊断
临床特点＋实验室检查＋父母调查
阳性＋基因分析
地中海贫血检查 1.血细胞分析 2.红细胞脆性试验 3.血红蛋白分析 4.地贫基因检测
第1-3项为筛查项目
地中海贫血初筛检查


1.血细胞分析
MCV < 80fl 和（或）MCH <27pg CV）<80fl为地贫表型阳 性，β地贫和中间型、轻型α地贫和部分静 止型α地贫基因携带者均为阳性，但有部分 静止型α地贫基因携带者是正常的。
地贫地域分布
α地中海贫血多见于黑人(黑人中25%至少有 一个基因缺陷)，β地中海贫血多见于地中海 地区或东南亚。 我国以广东、广西、海南、四川、重庆等省 区发病率较高，在北方较为少见。

Thalassemia
中国南方不同高发地
区人群携带率 1 ~ 23%
地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一
δ 四个类型，以β 和α 地贫最常见。
地贫临床类型

临床上将地贫分为轻、中、重三个临床类型。 (1)轻型：轻度贫血或无症状，一般在调查家族史时发现。 (2)中间型：轻度至中度贫血，患者大多可存活至成年。 (3)重型：出生数日即出现贫血、肝脾肿大进行性加重，黄 疸，并有发育不良，其特殊表现有：头大、眼距增宽、马鞍 鼻、前额突出、两颊突出，其典型的表现是臀状头，长骨可 骨折。骨骼改变是骨髓造血功能亢进、骨髓腔变宽、皮质变 薄所致。少数患者在肋骨及脊椎之间发生胸腔肿块，亦可见 胆石症、下肢溃疡。常见并发症有急性心包炎、继发性脾功 能亢进、继发性血液病。

地中海贫血基因诊断PPT课件

地中海贫血基因诊断PPT课件

临
床 中间型地贫：(+(高F)／ +(高F) 、+／+)
类
型 遗传性胎儿血红蛋白持续增多症(HbFα 2γ 2)
地中海贫血基因诊断
A.重型β 地中海贫血
患者不能合成β 链 α 链过剩而沉降到红细胞膜上，引起膜的性能改
变，发生严重的溶血反应，引起肝脾增大。 组织缺氧，促进红细胞生成素分泌，刺激骨髓增
珠蛋白基因的结构及表达
1.珠蛋白基因的结构
α 珠蛋白基因簇 16p13 β 珠蛋白基因簇 11p15
地中海贫血基因诊断
地中海贫血的分型
·α地中海贫血：根据造成人贫血病情的严重性将
其分为4种类型。
·β地中海贫血：根据造成病情的严重性分为3种类
型： ·重型地中海贫血 ·中间型地中海贫血 ·轻型地中海贫血
PCR 扩增
基因型分析
α地中海贫血的 基因诊断结果
地中海贫血基因诊断
PCR 扩增
缺失型突变检测PCR 反应条件为:95℃预变性5min， 98℃ 45s，66℃ 30s，72℃ 3 min，35个循环，最 后72℃延伸5 min。 非缺失型突变检测PCR反应条件为:94℃预变性5 min， 94℃ 60s，55℃ 30s，72℃60 s，35个循环，最后 72℃延伸5min。
地中海贫血基因诊断
反向点杂交( reversedot-blot, RDB)
将上述PCR扩增产物与膜条100变性10min,42℃杂 交4h以上,洗膜,加入酶标抗生物素蛋白,再次洗膜, 加入酶底物显色,观察结果。具体步骤按说明书进 行操作。
地中海贫血基因诊断
杂交结果判定
地中海贫血基因诊断
杂交结果判定
地中海贫血基因诊断

β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)

β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)

pcr扩增
DNA提取
利用特定的试剂从血细胞中提取出DNA。
pcr扩增
使用聚合酶链式反应（PCR）技术对DNA进行扩增，使其数量增加，便于后续 的检测。反向点Fra bibliotek交制备探针
将目标基因序列设计成特定的探针，并固定在尼龙膜上。
杂交反应
将扩增后的DNA与固定在膜上的探针进行杂交，通过碱基互 补配对原则，将目标基因序列特异性地结合在膜上。
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术提高检测的灵敏度和特异性，降 低检测误差。
要点二
基因组编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因组编辑技术，对β-地中海贫血基因 进行精确编辑和修复，从根本上治疗地中海贫血。
临床应用的拓展
早期筛查
将β-地中海贫血基因检测纳入新生儿筛查 计划，实现早期发现和干预，降低疾病对 患儿的影响。
β-地中海贫血基因检测(pcr反向点杂交法)
• β-地中海贫血基因检测介绍 • pcr-反向点杂交法介绍 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)流程 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)的临床意义
• β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点 杂交法)的未来发展
01
β-地中海贫血基因检测介绍
03
耗时长：需要进行PCR扩增和杂交反应， 整个过程需要一定时间。
04
对实验条件要求高：需要严格控制实验条 件，避免交叉污染和假阳性结果。
03
β-地中海贫血基因检测(pcr-反 向点杂交法)流程
样本采集和处理
血液样本采集
从患者静脉抽取适量血液，用于 后续的基因检测。
样本处理
将采集的血液进行离心，分离出 血浆和血细胞，保留血细胞用于 后续的DNA提取。

地中海贫血筛查及基因示意图精选幻灯片

地中海贫血筛查及基因示意图精选幻灯片
地中海贫血
特点
地域性疾病 溶血性疾病 遗传性疾病
热带、亚热带-丛林地区-沿海洋地带：蚊虫、疟疾。
突变的地贫基携因带者红细胞能抵御疟原虫的侵袭
ppt课件.
3
中国南方人群地贫基因携带率
地区
广西 广东 海南 云南 贵州 江西
地贫
17.6 8.5 12.7 9.8 4.2 ６.2
携带率(%) β地贫
--/αα
中间型
- -/ α α
- - αα -- αα
轻型
-α/αα
中间型
--/αα
-α αα -- αα
--/αα
αα/αα （25%）
正常
--/--
--/αα （25%）
中间型
-α/αα （25%） 轻型
--/αα （25%）
中间型
-α --
αα/αα （25%）
正常
中间型
--/αα
-- αα -- -α
--/αα -α/αα
（25%） （25%）
中间型
轻型
-- --
-α/-α
（25%） 中间型
β-地中海贫血
β地中海贫血
β地中海贫血是由于β珠蛋白基因缺陷所致β 珠蛋白合成障碍
（主要是基因点突变，少数是基因片段缺失）
β
11号染色体
β-地中海贫血基因型
β-地中海贫血基因位于第11号染色体上（2条单体
β+/ β
重型
（纯合子）
β0/β
（25%） 轻型
β0 / β
β /β
（25%） （25%）
轻型
正常
表现
轻型 （β+ / β）无症状，轻度贫血，肝脾不肿大。 中间型（β+ / β+）幼童期后，肝脾肿大，轻度黄疸，地贫面容。 重型（ β0 / β0、β + / β0）地贫面容，重度贫血，必须输血维持生命。

《β地中海贫血详解》PPT课件

《β地中海贫血详解》PPT课件
第十七页，共33页。
实验室诊断(zhěnduàn)
• 轻型地中海贫血： -血液涂片表现为血红蛋白过少着色不足 （红细胞低色素(sè sù)非常显著），以及小红 细胞症（类似于缺铁性贫血）。 -血液指标：红细胞平均体积（MCV）<75fl, 血红蛋白（Hb）通常>10,红细胞比容>30%, 红细胞分布宽度（RDW）<14%. -血红蛋白A2常常升高>3%,有时达到7-8%
来源(láiyuán)：Emirates Thalassemia Society
第十页，共33页。
一个(yī ɡè)遗传实例-续：
两个携带者婚配
来源(láiyuán)：Emirates Thalassemia Society
第十一页，共33页。
β地中海贫血症的类型(lèixíng)
轻型地中海贫血（微型）.
第十三页，共33页。
β地中海贫血症的类型(lèixíng)-续
重型地中海贫血(Cooley 贫血症)
由于不能获得血红蛋白的β链而产生，导致 非常严重并且若不进行治疗(zhìliáo)会致命的贫 血症。 它需要经常进行输血，但这将导致铁负荷 过重，这可以通过螯合作用的治疗以防患 者死于器官衰竭
第十四页，共33页。
第三十三页，共33页。
β地中海贫血症和疟疾(nüè ji)
地中海贫血症的红细胞保护机体免遭由恶 性疟原虫引起的严重的疟疾 这种效应与寄生虫在红细胞内的繁殖减少 有关(yǒuguān) 血红蛋白F的可变的持久性可能是上述效应 的其中一个贡献因子，它可以对疟疾血红 蛋白酶的消化作用有相对的抗性。
第十五页，共33页。
征兆 和症状 (zhēngzhào)
5- 社区教育计划，包括社区带头人和提供社 会支持。

β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法) ppt课件

β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法) ppt课件
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基 因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致， 是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、 CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox28(A→G)等位点。因本病多为点突变所致，故常 用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液 洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置 显色液避光显色20min
杂交反应条件按照试剂盒要求
结果判断 杂交膜条 β-28/βN标本
β-28/ β-28标本 βIVS-II-654/ βN标本
β CD41-42/ βN标本 βCD17/ βN标本
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；

地中海贫血基因检测和结果分析PPT课件

地中海贫血基因检测和结果分析PPT课件
地贫全套检查
一方正常，另一方 的指标降低
异常的一方做地贫全套检查
双方均为 α-地贫特征
双方均为 一方为α-地贫特征，另一
β-地贫特征ຫໍສະໝຸດ 方为ID或β-地贫特征遗传咨询
ID或β-地贫特征的一方 做α地贫分子诊断
-
+
单纯性ID或单
纯性β-地贫
夫妇双方基因诊断
精选2知02情1最同新意课件选择
α-地贫特征 ID β-地贫特征
Xiong F, et al. J Mol Diagn. 2011
Christina V，et al. Clini精ca选l C20h2e1m最is新tr课y.件2003
30
四、最新的地中海贫血检测方法
2、MLPA（多重连接探针扩增）
用于寻找未知缺失断裂点
Xiao-Feng Wei，et a精l.选A2n0n21H最e新m课a件tol. 2011
15.32
363
6.27
498
8.6
25
0.43
370
6.39
287
4.96
79
1.36
4
0.07
9
0.16
6
0.1
3
0.05
22
0.38
17
0.29
4
0.07
1 精选2021最新课件 1287
0.02
22.25
12
–10kb
5’
0kb
10kb
20kb
30kb
40kb
inter ξHVR
3’HVR
A
B
ψξ1 ψα2 ψα1
3.7 C
α2
α1 θ1

β型地中海贫血诊断治疗PPT课件

β型地中海贫血诊断治疗PPT课件

⑷反向点杂交法（RDB）
+ PCR 法
4. 中国人群的基因突变点
编号 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
表1. 中国人β地贫基因突变点一榄表
突变点 β 17（ A→ T）
HbE26（ G→ A） -28（ A→ G） β 41-42（ -TCTT） IVS-Ⅱ -654（ C→ T） β 71-72（ +A） IVS-Ⅰ -1（ G→ T） IVS-Ⅰ -5（ G→ C） -29（ A→ G） β 43（ （ G→ T） β 14-15（ +G） β 71-72（ +T） -30（ T→ C） β 27-28（ +C） ATG→ AGG +40~+43（ AAAC） -32（ C→ A） β 31（ -C） IVS-Ⅱ -5（ G→ C） IVS-Ⅱ -5（ G→ A） β 95（ +A） β 30（ AGG→ GGG） β 8-9（ +G）
24
1
40.3
βo
5
2
11.3
βo
1

22.6 β +/β？
0
4
6.5
β+
1
0
1.6
βo
0
1
1.6
βo
1
0
1.6
β+
1
0
1.6
βo
1
0
1.6
βo
1
0
1.6
？
45
17
100
三.重型β地贫的临床治疗
1.高量输红细胞
⑴ 原理：纠正机体缺氧，减少肠道吸收铁； 抑 制骨髓内、外造血，抑制内源性红细胞过度增 生；抑制睥大。 ⑵ 制品种类：浓缩RBC，添加液RBC， 洗涤 RBC，少白细胞RBC，年轻RBC ⑶ 输血方法：“hypertrasfusion”（高量输 血）输血后Hb 120-140g/L，维持>100g/L （4）必要性

地中海贫血优秀课件PPT

地中海贫血优秀课件PPT

β地中海贫血的传播（续）
·然而，如果两个携带者结婚，那么每次怀 孕，他们的子女有25％的机率成为非携带 者，50％的机率成为携带者（即患轻型地 中海贫血），25％的机率成为重型地中海 贫血患者。
2021/8/19
遗传学的一个例子 ：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ携带者与正常人结婚
2021/8/19
来源：阿联酋地中海贫血协会
遗传学的一个例子(续)：
2021/8/19
预防措施
·婚前检查，以确保夫妻双方不同为携带者。
·为地中海贫血患者、家庭和公众提供咨询服务 和健康教育。
·提供产前的地中海贫血检查。
·减少近亲结婚。
2021/8/19
地中海贫血和迁移
·接受地中海贫血高发区（如地中海周边地区） 移民的国家，应该意识到这个问题。
·有地中海贫血携带者的家族，特别是在邻近 的社区，可能由于近亲结婚而使患者（包括 重型地中海贫血）数量增加。
2021/8/19
致谢
·致谢
·我要感谢来自巴勒斯坦“地中海贫血患者之友 协会（TPFS）”的Hisham教授和BasharalKarmi教授提供的极有价值的信息。
·我同时要向巴勒斯坦美国研究中心（PARC） 致以我诚挚的感谢，是他们给了我在匹兹堡大 学进行研究的机会，我也是在那里准备了我的 这次演讲。
2021/8/19
发展中国家重型地中海贫血患者共同 面临的问题
·可用于输血的血液不足。
·可获得的甲碘酸去铁铵泵不足，只有少于 三分之一的病人可获得泵的治疗。
·治疗所需的高费用。
2021/8/19
发展中国家重型地中海贫血患者共 同面临的问题（续）
·血库所能提供的服务有限。
·得不到咨询服务。

β地中海贫血详解PPT文档33页

β地中海贫血详解PPT文档33页
5风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
β地中海贫血详解
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
•
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
•
27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克

β地中海贫血详解33页PPT

β地中海贫血详解33页PPT
β地中海贫血详解
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
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反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
杂交膜条
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管
B液 40ml
42 ℃预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
42 ℃洗涤15min
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液洗 膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置显 色液避光显色20min
杂交反应条件按照试剂盒要求
结果判断
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于 β-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的 单基因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变 所致，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传 病之一。在中国人群中常见的突变位点有CD4142(-TCTT)、CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和 TATAbox-28(A→G)等位点。因本病多为点突变所 致，故常用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。
【原理】
PCR技术原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链， 在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复 制成同样的两分子挎贝。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其 特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
【原理】
PCR技术原理
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶 （如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的 与模板DNA链互补的链。
重复循环变性--退火--延伸三过程,每一次循环使反 应体系中的DNA分子数增加约一倍,而且这种新DNA分 子又可成为下次循环的模板。理论上循环n次，就增 加2n倍，即DNA分子数呈指数式增加。当经30次循环后， DNA产量达230拷贝，约为109拷贝。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几 百万倍。
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
β-28/βN标本
41-42N 654N
41-42M 654M
43M
-32M
-28N -28M -29M
71-72N 17N
βEN
71-72M 17M
βEM
-30M 14-15M CAP
31N 31M IntM
【目的】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就 将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取 大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中 具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学 的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术， 而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能 检测中具有重要的应用价值。
27/28M IVS-I-1M IVS-I-5M
β-28/ β-28标本
41-42N 654N
41-42M 654M
43M
-32M
-28N -28M -29M
71-72N 17N
βEN
71-72M 17M
βEM
-30M 14-15M CAP
31N 31M IntM
27/28M IVS-I-1M IVS-I-5M
βIVS-II-654/ βN标本
41-42N 654N
41-42M 654M
43M
-32M
-28N -28M -29M
71-72N 17N
βEN
71-72M 17M
βEM
-30M 14-15M CAP
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；
THANK YOUSUCCESS2019/5/6可编辑
【操作步骤】
1.DNA获取（已准备好了）
2.PCR扩增（采用试剂盒） ： 反应液管（做好记号）
5000rpm，2秒
总体积25微升
加入 2ul DNA溶液
反应体系各组分的用量见理论课内容
PCR扩增条件
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，