地中海贫血基因检测和结果分析

四、最新的地中海贫血检测方法
2、MLPA（多重连接探针扩增）
用于寻找未知缺失断裂点
Xiao-Feng Wei，et al. Ann Hematol. 2011
四、最新的地中海贫血检测方法
3、毛细管电泳 可以检测α非缺失CS（Hb CS)和
βE地贫
Hb A Hb E
Hb A2
Can Liao, et al. European Journal of Haematology. 2010
224例
1349例
广西地中海贫血的流行分布
–10kb
5’
0kb
10kb
20kb
30kb
40kb
inter ξHVR
3’HVR
3’
2 1
2
1
– –MC – –BRIT – –MED – –SPAN – –THAI – –HW – –FIL – –SEA – 27.6 – 11.1
– 4.2
– 3.7 – 2.7 – 2.4
基因记为--/
丧失功能。
+地贫（也有称地贫2）： -珠蛋白基因保
基因记为-/
留有部分功能。
地中海贫血分类
2、按照肽链内切酶分型
缺失型地贫：珠蛋白肽链存在片段缺失而造
成功能缺陷
非缺失型地贫：珠蛋白肽链上不存在缺失，而是 （点突变） 由于基因的点突变造成的肽链功能 缺陷
地中海贫血分类
3、根据基因缺失或突变个数可分为：
大部分β地贫都是点突变型。
血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程
产前地贫携带者筛查策略
产检对象（孕妇及其配偶） 血液五分类分析（关注MCV和MCH）+血红蛋白电泳（Hb A2)
同时正常 仅异常血红蛋白
必要时测序或选择其 中一种地贫检测
双方某项指标 均同时降低
地贫全套检查
一方正常，另一方 的指标降低
四、最新的地中海贫血检测方法
4、DHPLC（变性高效液相色谱）
用于缺失型和突变型地贫都可以
李倩，南方医科大学论文，2010
四、最新的地中海贫血检测方法
5、基因序列测定（PCR+毛细管电泳）
用于未知突变位点或确定缺失片段的位置 由于仪器比较贵重，技术要求高，目前尚未在临床一线 推广，只在科研实验室里开展。
地中海贫血的实验室检测和结果分析
广西区人民医院检验科PCR实验室 李友琼
主要内容
一、什么是地中海贫血及分布 二、地中海贫血的致病机制 三、地中海贫血的基因诊断 四、最新的地中海贫血检测方法 五、检测结果分析及报告
一、什么是地中海贫血
定义：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋 白肽链合成减少或缺失，导致血红 蛋白的α链/非α链比例失衡，而引起 的一组遗传性溶血性疾病，亦称海洋性贫血
A – 28/N B IVS-II-654 /N
D
– 28/– 28
E CD41–Fra Baidu bibliotek2/ N
C CD17/N
F CD17/IVS-II-654
β–地中海贫血点突变分析结果
血涂片染色（包涵体）
Cornelis L H，Orphanet Journal of Rare Diseases， 2010
。 血红蛋白病：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋
白分子的一级结构发生改变，从而导致血红 蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性疾病 。
☆ 地中海贫血是最常见的血红蛋白病，珠蛋白合成
障碍性贫血为国内称呼，国外不用。
地中海贫血分类
地中海贫血分类
1、按照一个单倍型上的-珠蛋白基因的功能缺陷定义
0地贫（也有称地贫1） ：-珠蛋白基因完全
制
碱基替换
点突变 移码突变
二、地中海贫血的致病机制
三、地中海贫血基因分析
1、Gap-PCR 用于α和β等缺失型地贫的检测
F
G
SEA
A
B
ψξ1 ψα2 ψα1
3.7 C
α2
α1 θ1
4.2
D
E
原理：普通的酶无法扩增出长距离的片段，通过设计出与缺失序列的两侧翼 序列互补的引物，当存在缺失时，由于肽链靠近从而扩增出片段。
二、地中海贫血的致病机制
血红蛋白
链
链
红细胞 链
铁链 血红素
●胎儿血红蛋白主要由两条珠蛋白链、两条珠蛋白链组成，还含有 γ链、ɛ链、ζ链组成
●成年人的血红蛋白由两条珠蛋白链和两条珠蛋白链组成
二、地中海贫血的致病机制
11p15.3
β珠蛋白基因簇
HS 5 4 3 2 1 ε
Gγ Aγ
ψβ δ
β
HbA
α珠蛋白基因簇
三、地中海贫血基因分析
2、PCR-RDB 用于检测α和β点突变
PCR
显色
杂交
膜条
三、地中海贫血基因分析
地贫基因检测的策略：
α地贫：先检测常见缺失型，然后检测非缺失（点 突变），最后是未知的缺失和突变位点。 因为>90% α地贫为常见的三种缺失型
（--sea,-3.7,-4.2)。 β地贫：先检测点突变，然后检测少见的缺失型。
Azam Amirian MSc， et al. Archives of Iranian Medicine. 2011
四、最新的地中海贫血检测方法
6、母体血浆中胎儿游离核酸的测定
严提珍，国际输血及血液学杂志，2009
严提珍，国际输血及血液学杂志，2009
五、检测结果分析及报告
（一）地贫基因诊断
1 2 3 456 78 9
1、 - -SEA / 2、 / 3、 / 4、- -SEA /-4.2 5、- -SEA /-4.2 6、- -SEA /-3.7 7、 / 8、 - -SEA / 9、 DNA Marker
α缺失型地贫电泳结果
未检测到6种突变 （注意不是正常）
CS纯合 WS杂合
α非缺失杂交结果
异常的一方做地贫全套检查
双方均为 α-地贫特征
双方均为 一方为α-地贫特征，另一
β-地贫特征
方为ID或β-地贫特征
遗传咨询
ID或β-地贫特征的一方 做α地贫分子诊断
-
+
单纯性ID或单
纯性β-地贫
夫妇双方基因诊断
知情同意选择
α-地贫特征 ID β-地贫特征
α地贫分子诊断
- 血R正常的 +
单纯性ID或单
五、检测结果分析及报告
（三）基因诊断报告单 1、临床地贫基因报告
主要是常规试剂可以检测到的类型，一般都会包括被测样 本的信息，检测方法，检测试剂，检测者的签名，诊断结 果以及临床提示。
2、临床科研报告
由于常规检测不到，但是患者又必须进一步检测确定的罕 见或未知地贫类型。报告信息只包括被测样本信息，检测 方法，检测试剂，诊断结果及临床提示，没有检测者的签 名（不承担法律后果）。
静止型： 缺失1个基因，基因型记为-/ 1个基因突变，基因型记为/T
轻型： 缺失2个基因，基因型记为：--/或-/-
2个基因突变，基因型记为： T/T
中间型： 缺失3个基因，基因型记为：--/-
缺失与突变混合，基因型为：--/T或纯合突变
重型： 缺失4个基因，基因型记为：--/--
缺失与突变混合，基因型为：--/T
（ 0/ 0、 0/ +）
中国人HPFH和δβ-地贫的基因突变类型及 表型特征
世界地中海贫血的流行分布
广西地中海贫血的流行分布
共5789例
83845例3
Baise
790例
Liuzhou
1559例
1033例
Hezhou
Nanning
Yulin
Fangchengguang
Xiong , et al. Clin Genet 2010
一方做α地
纯性β-地贫
贫分子诊断
-+
胎儿产前基因诊断
四、最新的地中海贫血检测方法
1、融链曲线分析法 用于检测α或β缺失和点突变
原理：根据每条肽链都有自己的Tm值，从而可以通过温度差来判断
Thongperm, et al. Journal of Molecular Diagnostics .2010 Xiong F, et al. J Mol Diagn. 2011 Christina V，et al. Clinical Chemistry. 2003
引起珠蛋白表达降低的常见缺失突变类型分布
0kb
50kb
G A
LCR
100kb
150kb
Black Belgian Indian Malaysian 2 German Turkish Italian Gantonese Yunnanese Chinese S.E.Asian Taiwanese
地中海贫血分类
1、根据肽链的功能缺失
0地贫 ： 珠蛋白基因功能完全丧失，不能合成肽链 ＋地贫 ： 珠蛋白基因尚保留部分功能
2、根据临床症状
静止型地贫： 突变杂合子（ N/ +），中国人少见 轻型型地贫：突变杂合子（ N/ +、 0/ N） 中间型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子
（ +/ +、 0/ +） 重型地贫： 突变双重杂合子/突变纯合子
12 种见于中国人群的 2/ 1珠蛋白基因点突变
显性突变
5’
EXON 1 IVS 1
EXON 2
IVS 2 EXON 3
3’
http://globin.cse.psu.edu
启动子突变 异常剪接 起始密码突变 移码突变 无义突变 3’UTR突变
46 种见于中国南方人群的-珠蛋白基因点突变
中国南方人群最为常见的地贫类型
引起地中海贫血常见的基因缺失突变类型分步
CD30
2
5’
1
CD13
UTR EXON I
CD31
CD49
CD44
CD59
IVS I
EXON II
IVS II
CD78 CD74
CD122
CD125 CD142
EXON III
UTR
3’
CD118
http://globin.cse.psu.edu
Missense mutation Mini deletion or insersion Termination mutation Frameshift
地贫基因分析诊断报告单（ alpha 地贫）
新修改的报告单
α珠蛋白基因缺失和发生的三联体基因座的分子机制
HS40
16p13.3
ζ ψζ ψ 2 ψ1 2 1 θ
二、地中海贫血的致病机制
人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律
二、地中海贫血的致病机制
基因致病突变是地贫发生的分子基础
基 因
动态突变
串联重复的三核苷酸序列随着 世代的传递而拷贝数逐代累加
突 变
缺失
的 分 子
片段突变 重复 重排
机 静态突变