杂交瘤技术和单克隆抗体技术.ppt

3、免疫系统含有109以上淋巴细胞遍布全身，保证了它们在 任何部位都能迅速反应。淋巴细胞由骨髓中的原始干细胞不 断产生，经血液及淋巴系统循环，暂时停顿并积聚于称作淋 巴器官的特异化的结构中，在哺乳动物中就是淋巴结和肝脏。 在免疫反应过程中，免疫原积聚于一个淋巴器官中，这个淋 巴器官就变成了免疫反应的焦点。
七、一个有效免疫系统的成熟是由广泛的细胞间信பைடு நூலகம்交换来 调节的。
第二节、抗体分子
抗体是具有共同结构和功能形式的一大类糖蛋白。抗体分 成五类：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD（见表2-1）。
一、IgG类抗体有两个相同的抗原结合位点 含有抗原结合位点的两个区域被称作Fab片段，涉及到免 疫调节的蛋白区称作Fc片段，在Fab和Fc片段之间的部分称 作铰链区。
对于鼠，大体积注射常采用腹腔注射，若需缓慢释放则
采用肌注或皮下注射，若需立即释放宜采用静脉注射。
对于鼠来说，第二次和第三次免疫应间隔至少3周。 对于兔来说，每3~6周注射一次。 超免疫化动物血清主要含IgG抗体。其实质部分为特异性 抗体。抗原特异的IgG水平可达1mg/ml，这几乎等于血清中 总IgG水平的10%。
二、抗原来源
开始一个免疫程序之前，对制备抗原的考虑主要于抗原 所需的剂量和纯度。这应基于预计产生抗体的用途。如果
仅仅需要识别相应抗原的高特异性抗体，那么抗原必须要 相当纯，或抗原制备物用于制备单克隆抗体。
1、纯抗原 2、从聚丙烯酰胺凝胶中纯化抗原。 3、半抗原：半抗原若被偶联于大的蛋白分子上就能被 用于诱发抗体。半抗原起抗原决定簇作用，与B细胞表面 抗体结合，载体提供II级T细胞受体结合位点。总之，半 抗原应被偶联于可溶性载体上，如BSA。 4、合成多肽也要连接到载体上。
四、免疫系统能将外来微生物和分子与自身成分区别开来。
五、系统记忆每一次与外来抗原的遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆可以延续动物终生。
六、免疫反应的许多性质是通过克隆选择确定的
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急 剧分裂克隆）。
九、这些重组及其它机制产生了无数的抗原结合位点。 十、等位基因排斥确保在任一B细胞中只有重新排列的一 个轻链和一个重链被表达。产生不同重链和轻链的基因重组 不总是产生一个功能基因，在B细胞分化过程中，轻链重排 开始于κ区内。然后，若二倍体基因中的一个首先重排，产 生一个功能性等位基因，另一个拷贝则进行重组。若二个重 组都产生非功能性等位基因，那么重组就要λ位点开始，以同 样的机制产生功能性重链。一旦重组产生一个功能性抗体， 一个未知的机制就制止进一步重组。将抗原性结合位点固定 ，直到细胞死亡。这个机制叫等位基因排斥。它可以解释为 什么B淋巴细胞分泌的只有一种抗原结合位点的抗体和抗体 只有一种类型的轻链。 十一、其它：重组被用于生产各种类和亚类的抗体。
B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体的修饰型， 功能相当于受体。
毒性T细胞：携带结合抗原的细胞表面受体。 辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关 键的调节作用。
体液介导的适应性免疫反应：体液反应引发产生可结合外 来抗原的循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗体技术的基础。
淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体技术
1960年，法国的Barski等首先发现，两种不同类型的细 胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。与此同 时，日本的Okada也发现紫外线灭活的仙台病毒(Sandai virus)可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合，在此基础上用灭 活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。
氨基酸、 核苷酸库
氨基 蝶呤A
次黄嘌呤H 肌苷酸
脱氧核苷酸
次黄嘌呤磷酸核糖 转移酶(HGPRT)
胸腺嘧 啶核苷T
dGTP、 dTTP
DNA 合成
胸腺嘧啶核苷 激酶（TK）
杂种细胞的筛选：细胞融合带有一定的随机性， 除不同亲本细胞间的融合外，还伴有各亲本细胞的 自身融合。因此，在紧随细胞融合之后，必须设法 把含有两亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出 来。最简便的办法无疑是应用选择培养基，使亲本 细胞死亡，而仅让杂种细胞存活下来。为此，已先 后利用亲本细胞的药物抗性、营养缺陷型和温度敏 感性等遗传标记，建立了多种选择系统，并已成功 地用于杂种细胞的筛选。
一、免疫原性
许多外源分子、病毒或细胞单纯注射在实验动物体内能 引起强的抗体反应，而一些物质却不能，对于这些情况， 常可通过修饰抗原或改变宿主而使免疫系统反应增加。
好的免疫原分子必须具备以下条件： 1、抗原结合于原始B细胞表面抗体分子对于抗体反应是 绝对必要的。这个结合决定了产生抗体的特异性。因为表 面抗体分子上的抗原决定位点与分泌抗体的结合位点是一 致的。 2、它必须能促进B细胞与辅助T细胞间的信息交换。这 要求在两个细胞间有物理连接。即有一个位点被II级蛋白 及T细胞受体所识别。 3、通常它必须可被降解。
一个重链的可变区和一个轻链的可变区结合形成一个抗原 结合位点。可变区的异质性提供了动物有效进行免疫反应所 需的无数结合位点的基础。序列异质性并不是由整个可变区 的每一部分决定的，而是集中在与抗原接触的位点上。多数 可变性决定于每一个链的三个短区，它们形成轻链的三个超 变区和重链的三个超变区。这些超变区形成抗原抗体结合的 接触残基的主体，同时这些超变区位于扩展进入抗原反应区 的短环上。由于它们是实际的抗原结合位点，故被认为是互 补决定区。
第四讲 杂交瘤细胞和单克隆抗体技术
第一节、免疫的基本知识
一、免疫系统：分非适应性免疫和适应性免疫两类。 1、非适应性免疫是由非特异性反应的细胞介导的。如：巨 噬细胞的吞噬作用，泌细胞分泌的溶菌酶，以及中性细胞造 成的细胞裂解机制。 2、适应性免疫：是针对特定分子，而且可经反复暴露于外 源分子使之加强淋巴细胞合成细胞表面受体或分泌特异性蛋 白结合外源分子。这些分泌的蛋白称为抗体；可与抗体结合 的分子被称为抗原。当一个分子被用于诱导适应性反应时， 这个分子就被叫做免疫原。
1976年Kohler和Milstein创建了一个方法，他们将分泌一 种特异性抗体的B细胞和体外持续生长的浆细胞瘤融合，产 生的杂交细胞克隆表达了抗体生成的正常B细胞和浆细胞瘤 细胞的免疫球蛋白基因，同时也具有在体外无限增殖的能 力。为此创造了杂交瘤(hybridoma)这个名词，以描述一个 正常抗体生成细胞和一个浆细胞瘤细胞的融合产物。由于 他们的重要科学贡献，Kohler和Milstein在1984年荣获了诺 贝尔医学生理奖。
四、抗体重链的分子结构
重链的序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链含 有一个可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其它重 链含有附加的恒定区。
IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。
五、重链和轻链的可变区形成抗原结合位点
HAT选择培养基：HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄 嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮丝氨酸（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）的培养基。细胞为合成DNA所需要的嘌呤和嘧啶，可 由两条途径获得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸 （PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），进而转变为脱氧 鸟苷三磷酸（dGTP），及从脱氧尿苷酸（dUMP）合成脱氧 胸苷酸（dTMP），再转变为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）。这 一合成途径，可为加入的会抑制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基的 二氢叶酸还原酶的叶酸类似物A所阻断。此时，只有HGPRT+ 和TK+细胞才能通过另一条应急途径，利用外加的核苷酸的 “前体”H来合成IMP和利用T来合成dTMP，而得以有活下 来。相反，HGPRT－和TK－细胞则将因无法利用H和T来合成 DNA而死亡。因此，在HGPRT－和TK－细胞融合后，应用 HAT培养基即可将通过基因互补而同时获得HGPRT和TK酶 的杂种细胞筛选出来。
细胞介导的适应性免疫反应：毒性T淋巴细胞结合于外来 或感染的细胞，随后将这些细胞裂解，辅助T细胞参与该反 应。 二、免疫系统能特异性地对无数种分子反应。
免疫系统持续地受无数抗原刺激。免疫系统的一个主要形 式是它能合成大量的抗体及细胞表面受体。各个带有不同抗 原结合位点的抗体和T细胞受体与外来分子的结合提供了免 疫反应特异性的基础。
重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体的区别
IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们的重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。
重链的不同使这些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在 完成反应成熟的不同阶段发挥作用。这些差异主要是由于Fc 片段上的蛋白序列不同所致。
轻链只有两种：κ、λ。
三、抗体轻链的分子结构
比较轻链的氨基酸结构发现，轻链有一个恒定区和一个可 变区。轻链由220个氨基酸组成，分为两个区，每个区由大 约110个氨基酸组成。-NH2末端那半部分是异源性的，称为 可变区（V）；羧基末端那部分称为恒定区（C）。
恒定区有两种类型：一种是决定κ轻链的，另一种是决定 λ轻链的。κ轻链基因位于第6染色体上，而λ轻链的基因则 位于第16染色体上。
三、动物免疫
1、动物选择 Balb/c小鼠，6~8周龄；兔子生后约12周。 动物数：小鼠4~6只；兔子2~4只。
2、佐剂 免疫反应的非特异性刺激物叫做佐剂，诱导对可溶性抗原
的抗体反应必须使用佐剂。但对颗粒性抗原或全细胞抗原则 不是必须的。
佐剂包含两种因素：一是佐剂是储备性物质以防止抗原迅 速代谢；二是佐剂必须是可以非特异性地刺激免疫反应的物 质。实验时一般是将水溶液注入到佐剂中。 3、抗原剂量
六、功能性κ、λ轻链和重链基因的一个明显特征是在所有 细胞中这些基因转录后的选择性剪接是不同的（见图2）。 200个V区，4个功能性J区。
七、形成λ轻链pre-mRNA外显子也要重排（图3）。V-JC-J-C。