下载文档原格式
单克隆抗体制备的杂交瘤技术XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)一、实验目的：1.掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。
2.能运用杂交瘤技术来制备自己的单克隆抗体。
二、实验原理：（一）动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。
脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。
当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。
动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。
（二）细胞融合B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。
如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官,取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。
其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。
（三）杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。
细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。
内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是一种常用的遗传学实验方法，用于研究基因的功能和调控。
其基本原理是将两个不同品系或物种的细胞或组织相互融合，生成杂交细胞或杂交瘤。
这些杂交细胞或瘤细胞会融合两个品系或物种的基因信息，同时保留着两个母细胞的细胞器和细胞质基因。
杂交瘤技术的基本步骤如下：
1.选择母细胞：选择具有所需特性的两个不同来源的细胞或组织作为杂交的母细胞。
一般选择一个无能力生长但含有所需基因的细胞（称为donor细胞）和一个能够快速增殖但缺乏所需基因的细胞（称为host细胞）。
2.处理细胞：将两个细胞进行特定处理，使其融合在一起。
一种常用的方法是使用化学物质（如聚乙二醇）或电脉冲来增加细胞融合的效率。
3.筛选和培养：将融合后的细胞进行筛选，通常是通过添加相应抗生素或培养基来筛选并培养合适的杂交细胞或杂交瘤。
4.分离纯化：通过稀释法或细胞克隆等方法，将杂交瘤细胞分离并纯化，以获得纯的杂交细胞系或杂交瘤。
杂交瘤技术的应用非常广泛，主要用于以下方面：
1.产生单克隆抗体：通过杂交瘤技术，可以融合具有所需抗体的B细胞与快速增殖的癌细胞，得到能够大规模产生特定抗体的杂交瘤细胞系。
2.研究基因功能：将疾病相关的基因或调控元件与高增殖性的癌细胞融合，可以研究相关基因的功能及其在疾病中的作用机制。
3.生产重组蛋白：将所需基因与杂交瘤细胞融合，可以实现大规模生产特定蛋白质，并用于医药和生物工程领域。
总之，杂交瘤技术是一种有效的遗传学实验方法，通过细胞融合的方式结合两种细胞的特性，用于研究基因功能、产生单克隆抗体和生产重组蛋白等多个领域。
杂交瘤细胞筛选原理
杂交瘤细胞筛选原理是一种常用的实验方法，用于筛选具有特定功能的细胞株。
其基本原理是将转录有特定功能的基因（例如抗体基因）与癌细胞融合形成杂交瘤细胞，通过筛选和鉴定，最终得到具有所需功能的细胞株。
具体步骤如下：
1. 提取源细胞：从目标细胞（例如淋巴细胞）中提取RNA，
并提取通过免疫化学等方法获得的抗体。
2. 合成cDNA：使用逆转录酶将RNA转录成相应的cDNA，
得到基因的mRNA序列。
3. 构建DNA片段：将合成的cDNA与表达载体连接，构建一
个含有抗体基因的DNA片段。
4. 转染杂交瘤细胞：将构建的DNA片段转染至癌细胞中，使
之融合形成杂交瘤细胞。
5. 筛选与鉴定：在适当的培养条件下，对杂交瘤细胞进行筛选和鉴定，通常会使用抗体特异性分析、流式细胞术等方法。
6. 克隆化：从筛选并鉴定出具有所需功能的杂交瘤细胞中选择单个细胞克隆并扩大培养。
7. 检测功能：对所得的单克隆细胞株进行进一步的功能检测，
以确认其具备所需的功能。
通过以上步骤，可以筛选出具有特定功能的杂交瘤细胞株，常用于生产大量的抗体或进行其他特定功能的研究。
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。
通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。
二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。
通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。
2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。
3. 实验动物：小鼠。
四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。
2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。
3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。
5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。
五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。
2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。
3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。
5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理一、引言单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。
其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理1. B细胞与肿瘤细胞的融合杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤细胞。
在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产生的杂交瘤细胞株。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。
此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点1. 高度特异性和亲和力通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法1. 杂交瘤细胞的稳定性杂交瘤细胞的稳定性对于单克隆抗体的制备至关重要。
为了提高杂交瘤细胞的稳定性，可以采用多种方法，如对培养条件进行优化、添加生长因子等。
2. 克隆选择在杂交瘤技术中，克隆选择是一个非常重要的环节。
为了确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，需要对杂交瘤细胞进行筛选和分离。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制。
医学检验技术：杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是事业单位考试免疫学检验的一个重要的部分，大家对于杂交瘤技术比较熟悉可能还是因为在高中的生物大家就有接触过这一部分，学起来也不那么吃力了。
杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养,接种于小鼠腹腔,在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
技术本身包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化。
(一)小鼠骨髓瘤细胞
细胞株稳定，易于传代培养
细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子
该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶(HGPRT)的缺陷株
(二)免疫脾细胞
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫
(三)细胞融合
PEG(聚乙二醇)可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。
(四)杂交瘤细胞的选择性培养
HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷
1.脾细胞(指B细胞)在一般培养基中不能生长繁殖
2.骨髓瘤细胞
因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡
3.杂交瘤细胞
由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞
由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。
因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛选出来。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理介绍在生物医学研究和临床诊断中，单克隆抗体作为一种重要的实验工具和治疗药物被广泛应用。
其中，利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力的特点，成为研究人员的首选。
本文将介绍利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理。
杂交瘤技术概述杂交瘤技术是一种将体外培养的B细胞（淋巴细胞瘤）与骨髓瘤细胞融合，从而形成能够长期生长并分泌抗体的细胞株的方法。
这种技术利用了淋巴细胞瘤的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限生长能力，使得细胞株能够持续产生具有特定结构和功能的单克隆抗体。
杂交瘤技术的步骤利用杂交瘤技术制备单克隆抗体一般包括以下几个步骤：1. 免疫原注射首先，在动物体内注射免疫原，激发机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂质等。
免疫原的选择要根据研究目的和所需抗体的特异性来确定。
2. B细胞提取从动物体内采集淋巴组织，提取出具有特异性抗体的B细胞。
B细胞是产生抗体的主要细胞类型，其具有表面上能与抗原结合的B细胞受体（BCR）。
3. 骨髓瘤细胞准备获得与B细胞体表BCR相对应的骨髓瘤细胞株。
骨髓瘤是一种恶性浆细胞增生性疾病，该病的细胞具有无限生长的能力。
4. 细胞融合将提取的B细胞与骨髓瘤细胞进行体外融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的过程一般利用聚乙二醇（PEG）或电脉冲等方法实现。
5. 杂交瘤细胞筛选将杂交瘤细胞进行培养，并添加合适的选择性培养基，筛选出能够分泌特异性抗体的单个细胞克隆。
6. 单克隆抗体制备从筛选出的单个细胞克隆中，取出细胞进行进一步培养和扩增。
细胞培养过程中，单克隆细胞会不断分裂和分泌抗体，从而得到大量的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的原理利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理主要基于两个关键特性：1. B细胞多样性B细胞具有多样的B细胞受体，这使得它们能够识别和结合各种不同的抗原。
当机体暴露于免疫原时，B细胞会通过BCR与特异性抗原结合，并启动免疫反应。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要
制备步骤
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术也称免疫杂交或抗体杂交，是用生物学和化学原理创造出人造抗体，也可以称之为“免疫抗体杂交”。
它通过将特定基因段无细胞化学合成抗体与正常正常抗体不同种型的B细胞经免疫球蛋白结合物外溶胶连接起来，从而锁定它们在杂交抗体分子内部而形成杂交细胞，它们同时具有正常抗体结构的灵活性，并将合成的抗体的特异性的目的物结合到杂交抗体分子上，诱导杂交细胞生长，从而获得特异性的抗体。
二、单克隆抗体的主要制备步骤
(1)筛选实验：将目标蛋白质与抗原结合，合成抗原——抗体复合物，获得具有抗原识别能力的抗体解析表型细胞。
(2)定向克隆：在筛选步骤的B细胞中采用定向克隆技术，将抗原识别能力特异的B细胞从其他不特异的B细胞中挑选出来，使它们成为抗体库中的杂交瘤。
(3)表达克隆抗体：将各自的表达株根据特定蛋白质的表达量分类，并从抗体库中培养出单克隆表达株。
(4)纯化抗体：从单个杂交瘤表达抗体株中分离，纯化抗体，获得纯净的单克隆抗体。
