海洋放线菌KSC2_1次级代谢产物化学成分的分离与鉴定

三株海洋放线菌次级代谢产物的研究开题报告一、研究背景海洋放线菌是一种生物多样性极高的微生物群体，在海洋中占据了重要的地位。

而其主要代谢产物为次级代谢产物，这些代谢产物具有广泛的生物活性和药理作用。

近年来，随着海洋生物技术的发展，越来越多的海洋放线菌次级代谢产物被发现并应用于药物、化妆品等领域。

因此，对海洋放线菌次级代谢产物的研究具有重要的实际意义。

二、研究目的本研究旨在研究三株海洋放线菌的次级代谢产物，并分析其化学结构特点和生物活性，为进一步的药物开发和应用提供基础研究数据。

三、研究内容本研究将选取三株海洋放线菌作为研究对象，采用分离纯化和结构分析等方法，研究其次级代谢产物，并对产物进行化学鉴定和药理活性测试。

具体研究内容如下：1. 海洋放线菌分离与筛选：通过海洋样品采集、分离纯化和培养等方法，筛选常见的海洋放线菌，选取具有代谢活性的菌株。

2. 次级代谢产物提取与分离：对选定的海洋放线菌进行分菌株培养，使用有机溶剂、萃取等方法提取其次级代谢产物，并采用柱层析、高效液相色谱等方法对产物进行分离纯化。

3. 化学特性分析：通过核磁共振、质谱和紫外光谱等方法鉴定次级代谢产物的化学结构特征，确定其分子式、分子量和构象等信息。

4. 生物活性测试：采用细胞培养技术和小鼠模型等方法，对次级代谢产物的抗肿瘤、抗炎、抗菌等药理活性进行测试。

四、研究意义1. 通过研究海洋放线菌次级代谢产物的化学结构特征，可以为二次代谢产物的药物开发提供借鉴和参考。

2. 对次级代谢产物的生物活性研究，可为开发具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等药理活性的新药提供理论基础。

3. 鉴定和筛选出具有生物活性的菌株和代谢产物，有助于深入挖掘海洋生物资源，为海洋生物技术的发展提供新的思路和方向。

三株海洋放线菌次级代谢产物的研究中期报告
本研究旨在分析三株海洋放线菌的次级代谢产物，包括提取、纯化
和结构鉴定。

截至目前为止，已经完成了以下工作：
1.菌株的筛选和培养
筛选了三株海洋放线菌，分别命名为M1、M2和M3。

这些菌株在富含葡萄糖的土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长出优质的菌落。

我们选择使用玉米汁培养基进行大规模菌体培养。

2.次级代谢产物的提取和分离
通过对培养基中的菌体进行提取和分离，从而获得了三种次级代谢
产物。

3.分离和纯化
通过色谱技术（包括硅胶柱层析、倒置层析和HPLC）对次级代谢产物进行纯化和分离。

在M1和M2菌株中，我们成功地分离了目标化合物，并获得了高纯度的结晶物质。

在M3菌株中，由于与其它化合物的相互作用，需要进一步优化分离纯化的步骤。

4.结构鉴定分析
使用一系列的光谱技术（包括核磁共振、质谱和红外光谱）对M1和M2中的化合物进行了结构鉴定和确认。

在M3中，仍需使用更多的化学
方法进行分离和鉴定。

总的来说，我们已经成功地获得了三种海洋放线菌的次级代谢产物，并对其中两种进行了结构鉴定。

下一步将会进一步优化分离纯化的步骤，并对M3的化合物进行更深入的研究和鉴定。

细胞毒活性海洋放线菌的筛选及两株目标菌株次级代谢产物的研究３筛选样品的准备将冰箱保藏的菌株接于原斜面培养基上，于２８＂Ｃ培养箱中活化培养５至８天后，分别接种到５ｍＬ试管液体培养基中，于２８＂Ｃ试管摇床中２４０ｒｐｍ振荡培养７天。

取全部发酵物，超声破碎菌体细胞，按体积比加入２倍量的甲醇，静置过夜，离心取上清液，浓缩至干，所得固形物为活性测试样品。

４活性筛选结果４．１海虾生物致死法：在用海虾生物致死法测试的２６２株放线菌发酵样品中，１００Ｊｆ，ｇ／ｍＬ的有活性菌株共有７８株。

４．２抑菌活性筛选：２６２株放线菌发酵样品经抑菌活性筛选之后，有３２株对至少一种致病菌有活性。

４．３肿瘤细胞筛选：在海虾生物致死法初筛有活性的７８株放线菌样品中，经肿瘤细胞二级复筛，共有１７株在终浓度１００ｕｇ／ｍＬ时对Ｋ５６２细胞显示了不同程度的细胞毒活性。

其中，１３株菌株在终浓度１０＃ｇ／ｍＬ仍显示较强的活性。

部分活性结果参见Ｆ睡１．２．１。

细胞毒活性海洋放线菌的筛选及两株目标菌株次级代谢产物的研究第三节小结本章采用改良的９６孔板海虾生物致死法和抑菌试验作为初筛模型，成本低廉，测试样品用量少，可筛样本数大，可以扩大筛选面、加快筛选速度，故可通过大规模筛选，快速排除绝大多数无活性的菌株，具有十分显著的优越性。

复筛采用流式细胞技术，结合镜检观察细胞形态学变化，选择有限的初筛有效菌株，专门检测具有细胞周期抑制、细胞凋亡及坏死性细胞毒等活性的菌株，具有灵敏、微量、快速的优点。

结合这两种模型进行分级组合筛选，充分发挥两种模型各自的长处，形成了细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及细胞毒等抗癌活性微生物菌株的简便快速且经济可行的组合筛选模式，大大缩小了复筛样本数目、减少了流式细胞术筛选的工作量、大幅度降低了成本，适用于大量菌株抗肿瘤活性的体外筛选。

本章从采自威海、福建、广东的１０个海泥样品中共分离得到放线菌２６２株，并利用组合筛选模式对这２６２株放线菌进行了活性筛选。

海洋放线菌—药物开发的新兴资源蔡超靖， 丁彦博， 单越琦， 穆云龙（华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心, 石家庄 050015）摘 要：近些年，海洋放线菌成为新药研发的重要来源，引起人们的关注，本文综述了海洋放线菌在分离方面取得的成绩，并介绍了通过传统筛选方法分离得到的生物活性代谢物，以及在与新化合物相关的基因挖掘和生物合成基因簇的异源表达方面取得的进展。

关键词：海洋放线菌； 活性代谢产物； 基因组学； 异源表达中图分类号：R978.1 文献标识码：A 文章编号：1001-8751(2012)01-0022-08Marine Actinomycetes －an Emerging Resource for the Drug DiscoveryCai Chao-Jing ， Ding Yan-Bo ， Shan Yue-Qi ， Mu Yun-Long（New Drug Research & Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, National Microbial Medicine Engineering & Research Center, Hebei Industrial Microbial Metabolic Engineering Research Center, Shijiazhuang 050015）Abstract: As an important resource of the new drugs, more and more attentions were paid on marine actinomycetes recently. This review highlights achievements in the isolation of marine actinomycetes, some examples of bioactive metabolites identi fied by traditional screening, and presents new progress in the field of genome mining leading to the discovery of novel compounds and heterologous expression of biosynthetic gene clusters.Key words ：marine actinomycetes ； bioactive secondary metabolites ； genomics ；heterologous expression收稿日期：2011-11-15作者简介：蔡超靖，工程师， 研究方向：微生物来源的新药筛选。

海洋新放线菌及其次级代谢产物研究进展【摘要】由于自身特殊的生存环境，海洋放线菌具有复杂独特的代谢途径，产生了诸多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，这些活性代谢产物为新抗生素的发现提供了丰富的先导化合物，有些已经进入临床前研究。

本文简要介绍近十几年从海洋样品中分离到的放线菌新种属及其次级代谢产物研究概况。

【关键词】海洋放线菌；代谢产物； Salinispora； Verrucosispora；MarinisporaABSTRACT Due to the special living environment， marine-derived actinomycetes possess distinct and complex metabolic capabilities，resulting in wide persity of their secondary metabolites in chemical structure and biological activity. Among them， many valuable leading compounds were obtained for discovery of new antibiotics， and some had been selected for preclinical study. The research advances in discovery of new actinomycetes and their secondary metabolites were briefly reviewed in this paper.KEY WORDS Marine-derivedactinomycetes;Metabolites;Salinispora;Verrucosispora;Marinispora放线菌是一类高(G+C)%的革兰阳性细菌，与人类关系密切。

海洋放线菌的分类鉴定一、放线菌㈠、放线菌的分布放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界。

不论数量和种类，以土壤中最多。

河流和湖泊中，放线菌数量不多，大多为小单孢菌、游动放线菌和孢囊链霉菌，还有少数链霉菌。

海洋中的放线菌多半来自土壤或生存在漂浮海面的藻体上。

海水中还存在耐盐放线菌。

放线菌有一种土霉味，使水和食物变味，有的放线菌也能和霉菌一样使棉毛制品或纸张霉变。

放线菌主要能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂，最主要的致病放线菌是结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，可导致人类的结核病和麻风病。

放线菌最重要的作用是可以产生、提炼抗生素，目前世界上已经发现的2000多中抗生素中，大约有56%是由放线菌（主要是放线菌属）产生的，如链霉素、土霉素、四环素、庆大霉素等都是由放线菌产生的。

此外有些植物用的农用抗生素和维生素等也是由放线菌中提炼的。

㈡、放线菌的形态与结构放线菌菌体为单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成，最简单的为杆状或具原始菌丝。

放线菌是一种革兰氏阳性菌。

放线菌菌丝细胞的结构与细菌基本相同。

根据菌丝形态和功能可分为营养菌丝、气生丝和孢子丝三种。

⑴营养菌丝匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。

营养菌丝一般无隔膜；直径0.2-0.8微米，但长度差别很大，短的小于100微米，长的可达600微米以上；有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、蓝、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性色素，则使菌落吨呈现相应的颜色。

色素是鉴定菌种的重要依据。

⑵气生菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。

它叠生于营养菌丝上，以至可覆盖整个菌落表面。

在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，约1-1.4微米，其长度则更悬殊。

直形或弯曲而分枝，有的产生色素。

⑶孢子丝气生菌丝上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝。

孢子丝的形状和在气生菌丝上的排列方式，随菌种而异。

孢子丝的形状有直形、波曲和螺旋形。

海洋生物中有机化合物的分离和结构鉴定是海洋化学的重要研究领域。

由于海洋环境的独特性，海洋生物中所含有的有机化合物具有独特的结构和活性，其具有重要的生物学和药物学研究价值。

本文将从海洋生物中有机化合物的来源、分离和结构鉴定三方面进行探讨。

一、海洋生物中有机化合物的来源海洋生物是指生活在海洋中的各种生物，包括浮游生物、底栖生物和海藻等。

由于海洋环境的复杂性和多样性，海洋生物中所含有的有机化合物种类繁多，包括碳水化合物、蛋白质、核酸、脂类和次生代谢产物等。

其中，次生代谢产物是海洋生物中具有重要生物学和药物学研究价值的有机化合物。

所谓次生代谢产物，是指海洋生物在生长和繁殖过程中所产生的一类具有生物活性的化合物。

这些化合物并非生理代谢产物，而是由某些酶催化合成的具有特定的结构和生物学活性的分子，如细胞毒素、抗生素、抗肿瘤化合物等。

次生代谢产物在海洋生物中广泛存在，而其种类和结构的多样性则为提出了挑战。

二、海洋生物中有机化合物的分离海洋生物中的次生代谢产物种类繁多，而其含量又较低，因此需要进行有效的分离和提取。

分离方法主要有以下几种：1、萃取法萃取法是分离海洋生物中有机化合物的最常见方法之一。

它适用于萃取脂肪类物质、芳香族化合物、酚类化合物和生物碱等。

不同化合物的萃取液可使用不同的有机溶剂进行净化。

2、色谱法色谱法是现代有机化学中最重要的分离方法之一。

它包括分子筛、硅胶、逆相、离子交换、气相、高压液相和超临界流体等不同类型的色谱。

该方法优点在于其分离效率高、分离精度高、分离时间短等。

3、电泳法电泳法通常用于分离带电的化合物，如脂肪酸、氨基酸等。

该方法可根据化合物的电荷性质进行有效分离，并且操作简单、成本低。

三、海洋生物中有机化合物的结构鉴定对于分离得到的有机化合物，必须进行结构鉴定才能确定其确切的化学结构和生物活性。

在这包括了以下几种方法：1、质谱法质谱法是一种通用的化合物分析方法，它可用于分析目标化合物的分子量、分子结构和化学性质等多个方面。

海洋细菌代谢产物的分离纯化与鉴定海洋是一个生物多样性极高的生态系统，其中微生物数量巨大，而海洋微生物的代谢产物则是各种生物活性物质和化学品的重要来源。

其中，海洋细菌是抗生素和化合物的主要生产者。

因此，分离纯化和鉴定海洋细菌代谢产物是研究海洋微生物学和发现新药物的重要途径。

分离纯化海洋细菌分离纯化海洋细菌是鉴定其代谢产物的重要步骤。

为了确定海洋细菌的生态基础，首先需要进行采样。

海洋样品可以从许多地方采集，例如海洋底部、沿海潮汐区、沿海海洋、开阔的海洋水域等。

分离出的微生物可以通过灭菌肉汤养殖以增强生长条件，其排泄代谢产物会被累积和释放。

分离纯化海洋细菌的方法有多种，例如通过筛选、稀释、差异培养和质量分析等方法。

所有这些方法的目的是将海洋微生物从混合群体中分离出来，进一步纯化其代谢产物。

鉴定海洋细菌代谢产物鉴定海洋细菌代谢产物是海洋微生物学的重要难题之一。

这需要大量的实验，以确定侵入生物、细胞生长、当地（限制性）生态条件和代谢物的量和结构。

海洋细菌代谢产物包括抗生素、生物硅石、环境尤为适合的化合物等。

这些化合物的特性会随着海洋环境和海洋生物的质量量和变化而发生变化。

因此，只有通过多个实验技术来鉴定海洋微生物学和代谢物学的目的。

其中，从海洋细菌过滤液、生长底物和培养物中分离代谢物是鉴定海洋细菌代谢物的重要途径之一。

利用多种技术进行筛选、分离、纯化和鉴定海洋细菌代谢物是发现新药物和化学品的主要途径之一。

海洋细菌代谢物是一些重要的生物活性物质，例如抗生素、生长因子和抗肿瘤化合物等。

随着科学技术的不断发展，人们将有更多的机会去发现这些化合物，并将它们加以应用，使其为人类健康和经济带来更多的福利。

一株海洋放线菌次生代谢产物的分离鉴定及抑菌活性研究放线菌,尤其是链霉菌,作为抗生素的重要来源,一直以来都是天然产物研究的热点之一。

本文以德国北海海水中分离到的一株海洋放线菌为研究对象,通过对其16S r DNA测序鉴定其与链霉菌Streptomyces sp.strainnenu_DS₂1有99%的同源性。

本实验将该菌编号为AC1。

通过初期大米培养基发酵,发现其代谢产物种类丰富,且乙酸乙酯及正丁醇萃取部分对水稻纹枯病菌、梨黑斑病菌表现出良好的抑菌活性。

对该菌采用大米发酵以及高氏一号液体培养基发酵,之后用硅胶柱、凝胶柱、C18反相柱以及高效液相色谱柱等色谱分离纯化方法结合薄层色谱分析对其发酵产物进行分离纯化,对分离得到的代谢产物成分采用质谱（MS）以及1D和2D 核磁（1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HSQC）等波谱技术进行结构鉴定,并进行抑菌活性的研究,最终结果如下:（1）从AC1的大米发酵代谢产物中分离出了编号为I-VIII共8个单体化合物。

其中I号化合物为2,3-dihydroxybenzamide,II号化合物为pyramidamycin B,VIII号化合物为flufuran,V、VI、VII号化合物为首次从自然界中分到的酰胺类天然产物,III、IV为新的化合物。

I,II,III,IV,VII号化合物为苯甲酰胺类化合物,V,VI,VIII号化合物为呋喃类化合物。

从高氏一号液体发酵代谢产物当中分到了IX和X两个单体化合物.其中IX号为苯甲酰胺类化合物3-[（3’-amino-3’-oxoprop-1’-en-2’-yl）oxy]benzamide。

X号化合物为新的链型酰胺类化合物。

在分离鉴定的10个化合物当中,VIII 化合物为该菌产生的主要成分。

（2）将分离得到的10个化合物采用滤纸片扩散法对番茄灰霉病菌、苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、水稻纹枯病菌、玉米大斑病菌5种植物病原真菌以及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种病原细菌作体外抗菌实验,筛选其中具有抗菌活性的成分,其中VIII化合物对番茄灰霉病菌、水稻纹枯病菌、苹果斑点落叶病菌都具有一定的抑菌活性,V,VI化合物则表现出对枯草芽孢杆菌的抑制活性。

海洋样品中放线菌菌株的分离及其抗生素生物合成基因簇的挖掘近些年来,由于抗生素的滥用,导致病原微生物对药物产生耐药性的速度要远远快于新型药物发现的速度。

这就要求我们必须采用其他有效的方法来获得新型抗生素。

随着陆生放线菌研究的日益完善,现在从陆生放线菌中发现新型次级代谢产物应用于新药开发的几率越来越小,而海洋中的微生物由于不同于陆生的环境,会产生一些不同的次级代谢产物。

因此,自上世纪八十年代,人们开始重视海洋放线菌资源的开发。

随着测序技术的迅猛发展,自2002年天蓝色链霉菌的基因组序列被测定之后,越来越多的链霉菌基因组测序完成。

分析这些基因组信息,我们发现大多数链霉菌都含有几十个与代谢产物有关的基因簇。

但是目前却只找到了很少量的基因簇相对应的化合物,如果能够使这些沉默的基因簇得到表达,那么将能够产生大量有活性的化合物。

基于上述几点,我们将研究的重点放在了海洋放线菌上,将从海洋泥样中获得的链霉菌在异源表达宿主天蓝色链霉菌M1 152中进行异源表达,期望能够筛选到有活性的化合物。

本实验针对从北极、南极、南海获得的50份泥样进行了放线菌的分离,共获得了七株放线菌。

对已分离获得的放线菌,进行了 16SrDNA测序确定了它们的分类地位,其中三株分离菌为诺卡氏菌,四株为链霉菌。

选取了实验室常用的培养基用来对各菌株进行培养,检测其最适的产孢培养基。

另选用了实验室常见的生测指示菌检测了这几株海洋放线菌的生物活性,从其中挑选出抗菌谱广且抗菌活性高的42#菌株作为研究对象,构建其cosmid文库,得到了插入片段约42kb的文库。

将构建好的cosmid文库通过接合转移的方式转至天蓝色链霉菌M1 152中,对获得的接合转移子进行生物活性的分析,得到了三个阳性接合转移子,经分析发现这三个cosmid为不同的粘粒。

选取其中活性较好的42#-17B4 cosmid进行测序,利用软件Frameplot4.0对42#-17B4cosmid的序列进行ORF的预测分析,发现它大约包含有18个ORF,分析这些ORF的信息,认为这一基因簇所产的化合物应该是一类具有很强极性的NRPS类代谢产物,且通过对M1 152/42#-17B4的活性物质发酵并粗提后利用HPLC及LC-MS对其进行分析,在R3培养基的发酵平板上发现了一个极性较大,分子量—为380.4的化合物,在GYM发酵培养基上发现了一个分子量为549.4的化合物。

海洋放线菌的培养鉴定与分离方法培养方法：1.海水培养基：海洋放线菌适应于富含海洋盐分的培养基。

一般的海水培养基包括海水、海营养盐、葡萄糖等成分。

2.杀菌处理：将培养基加热至沸腾，常温下过滤，或使用其他杀菌方法，如过滤器、紫外线照射等，以确保培养基无菌。

3.接种：将海洋样品（如海水、海洋沉积物等）加入到培养基中，翻腾混匀。

4.培养条件：通常在28-30℃下培养，选用适当的培养时间和转速，类似陆生放线菌的培养条件。

鉴定方法：1.形态学特征分析：观察海洋放线菌的形态特点，如菌落形态、颜色、边缘、透明度等。

2.生理生化特性检测：通过检测海洋放线菌的生理生化特征，如产生酸、氧化还原反应、产生酶、糖水解等。

3.生长特性分析：测定海洋放线菌的生长曲线、最适生长温度、最适生长pH等。

4.分子生物学鉴定：利用分子生物学技术，如16SrRNA序列分析、DNA-DNA杂交、脱氧核糖核酸酶电泳等，对海洋放线菌进行鉴定。

分离方法：1.稀释平板法：将海洋样品连续稀释后，取适量的稀释液均匀涂布于固体培养基平板上，在适当的温度下培养，待菌落形成后，进行分离和鉴定。

2.琼脂块分离法：将海洋样品均匀涂布于琼脂块上，培养至菌落形成后，将菌落分离，获得单菌落。

3.过滤法：将海洋样品过滤后，将过滤膜放置在含有适宜营养物质的培养基上，培养至菌落形成，进一步分离和鉴定。

4.琼脂滴定法：将海洋样品加入到含有适宜营养物质的琼脂液中，混合均匀后，滴定在含有固体琼脂的平板上，培养待菌落形成后，进行分离和鉴定。

总结：海洋放线菌的培养鉴定与分离方法主要包括培养基的选择、杀菌处理、接种、培养条件的确定等方面。

鉴定方法可以通过形态学特征分析、生理生化特性检测、生长特性分析和分子生物学鉴定等技术。

分离方法可以采用稀释平板法、琼脂块分离法、过滤法和琼脂滴定法等。

这些方法可以帮助研究人员获得纯培养的海洋放线菌菌种，为进一步的研究和利用奠定基础。

江西农业大学学报㊀２０１８，４０（５）：１０５５－１０６１ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ｊｘａｕ．ｅｄｕ．ｃｎＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＪｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓＤＯＩ：１０．１３８３６／ｊ．ｊｊａｕ．２０１８１３３张岗，庄玲萍，许莉，等．海洋来源放线菌ＨＮ⁃Ｅ３１次生代谢产物的分离与鉴定［Ｊ］．江西农业大学学报，２０１８，４０（５）：１０５５－１０６１．海洋来源放线菌ＨＮ⁃Ｅ３１次生代谢产物的分离与鉴定张㊀岗１，２，庄玲萍１，２，许㊀莉１，２，赵㊀晶３，叶子坚４∗，罗联忠１，２∗（１．厦门医学院厦门市海洋医用天然产物与细胞工程重点实验室，福建厦门３６１０２３；２．厦门医学院海洋生物医药资源福建省高等学校应用技术工程中心，福建厦门３６１０２３；３．厦门大学福建省海陆界面生态环境重点实验室／海洋与地球学院，福建厦门３６１１０２；４．厦门医学院医学技术系，福建厦门３６１０２３）摘要：利用反相硅胶柱色谱㊁ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶柱色谱㊁半制备高效液相色谱等分离方法，对采自中国南海的鸟氨酸微菌属放线菌ＨＮ－Ｅ３１发酵液乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行分离研究，通过１ＨＮＭＲ㊁１３ＣＮＭＲ和质谱等波谱技术，并参照相关文献数据，对化合物进行结构鉴定㊂结果共分离得到了１２个化合物，分别鉴定为：环（脯－缬）二肽（１）㊁环（脯－亮）二肽（２）㊁环（脯－异亮）二肽（３）㊁环（脯－苯丙）二肽（４）㊁环（亮－丙）二肽（５）㊁环（异亮－丙）二肽（６）㊁苯丙氨酸（７）㊁３－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｙｌ－ｉｎｄｏｌｅ（８）㊁３－吲哚甲醛（９）㊁水杨酸（１０）㊁尿嘧啶（１１）和对羟基苯甲醛（１２）㊂上述化合物均为首次从鸟氨酸微菌属放线菌中分离获得㊂关键词：鸟氨酸微菌属；化学成分；环二肽；结构鉴定；海洋微生物中图分类号：Ｑ９３９．１３＋２㊀㊀文献标志码：Ａ㊀㊀文章编号：１０００－２２８６（２０１８）０５－１０５５－０７ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｅｃｏｎｄａｒｙＭｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｆｒｏｍＭａｒｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅＨＮ⁃Ｅ３１ＺＨＡＮＧＧａｎｇ１，２，ＺＨＵＡＮＧＬｉｎｇ⁃ｐｉｎｇ１，２，ＸＵＬｉ１，２，ＺＨＡＯＪｉｎｇ３，ＹＥＺｉ⁃ｊｉａｎ４∗，ＬＵＯＬｉａｎ⁃ｚｈｏｎｇ１，２∗（１．ＸｉａｍｅｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｒｉｎｅＭｅｄｉｃｉｎａｌＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓａｎｄＣｅｌｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＸｉａｍｅｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ３６１０２３，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒｆｏｒＭａｒｉｎｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅ⁃ｓｏｕｒｃｅＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓｉｎＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＸｉａｍｅｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ３６１０２３，Ｃｈｉｎａ；３．ＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｏａｓｔａｌＥｃｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｉｅｓ，ＸｉａｍｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａ⁃ｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ３６１１０２，Ｃｈｉｎａ；４．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＸｉａｍｅｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ３６１０２３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｉｎｔｈｅｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅｅｘｔｒａｃｔｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｆｒｏｍａｎａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅＯｒｎｉｔｈｉｎ⁃ｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｓｐ．（ＨＮ⁃Ｅ３１）ｔｈａｔｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＳｅａ，ｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｍａｉｎｌｙｂｙｕｓｉｎｇＯＤＳｓｉｌｉｃａｇｅｌｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ⁃２０ｇｅｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｓｅｍｉ⁃ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅＨＰＬＣ．Ｔｈｅｓｔｒｕｃ⁃ｔｕｒｅｓｏｆｏｂｔａｉｎｅｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｅｒｅｅｌｕｃｉｄａｔｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆ１ＨＮＭＲ，１３ＣＮＭＲ，ＭＳ，ａｎｄｃｏｍｐａｒｉｎｇｗｉｔｈｓｐｅｃｔｒａｌ㊀㊀收稿日期：２０１７⁃１２⁃１２㊀㊀修回日期：２０１８⁃０２⁃２６基金项目：国家自然科学基金项目（３１２０１９６９）和厦门市海洋与渔业局科研项目（１７ＧＹＹ００８ＮＦ０４）ＰｒｏｊｅｃｔｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（３１２０１９６９）ａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅ⁃ｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔｏｆＸｉａｍｅｎＯｃｅａｎｉｃａｎｄＦｉｓｈｅｒｙＢｕｒｅａｕ（１７ＧＹＹ００８ＮＦ０４）作者简介：张岗（１９８０ ），男，博士生，讲师，主要从事天然产物开发研究，ｚｇ＠ｘｍｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ；∗通信作者：叶子坚，教授，ｙｚｊ＠ｘｍｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ；罗联忠，副教授，ｌｚｌｕｏ＠ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ㊂㊃６５０１㊃㊀江西农业大学学报第４０卷ｄａｔａｒｅｐｏｒｔｅｄｉｎｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｓ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，１２ｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｖａｌ）（１），ｃｙ⁃ｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｌｅｕ）（２），ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｉｌｅ）（３），ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｐｈｅ）（４），ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ａｌａ）（５），ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｉｌｅ）（６），ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（７），３－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｙｌ－ｉｎｄｏｌｅ（８），ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ（９），ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ（１０），ｕｒａｃｉｌ（１１）ａｎｄｐ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ（１２），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｓｅｔｗｅｌｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｄＯｒｎｉ⁃ｔｈｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｓｐ．ｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｓｐ．；ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｅｓ；ｃｙｃｌｉｃｄｉｐｅｐｔｉｄｅ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｍａｒｉｎｅｍｉｃｒｏ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍ海洋微生物一直是生物活性化合物的重要来源［１］㊂其中，海洋放线菌次生代谢产物结构新颖，具有抗菌㊁抗肿瘤㊁杀虫和酶抑制等多种活性，在海洋药物研究中占据重要地位［２］㊂从海洋放线菌中挖掘和开发结构新颖的活性产物，对于人类健康产业的发展具有重要的现实意义㊂鸟氨酸微菌属在地球上分布较为广泛，海洋［３］㊁土壤［４］等区域以及动㊁植物体内［５⁃６］均有发现，但该属菌种代谢物质的化学成分研究还鲜有报道㊂我们从南海深海海泥中分离获得一株鸟氨酸微菌属放线菌Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｓｐ．，命名为ＨＮ－Ｅ３１，前期活性筛选发现其发酵产物具有抑制枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌生长的活性（未发表）㊂为进一步了解该菌株的活性代谢产物类型和应用价值，本课题组对其发酵液乙酸乙酯萃取部位进行了较系统的化学成分研究㊂从中发现了１２个化合物，分别为：环（脯－缬）二肽（１）㊁环（脯－亮）二肽（２）㊁环（脯－异亮）二肽（３）㊁环（脯－苯丙）二肽（４）㊁环（亮－丙）二肽（５）㊁环（异亮－丙）二肽（６）㊁苯丙氨酸（７）㊁３－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｙｌ－ｉｎｄｏｌｅ（８）㊁３－吲哚甲醛（９）㊁水杨酸（１０）㊁尿嘧啶（１１）和对羟基苯甲醛（１２），它们均为首次从鸟氨酸微菌属中分离获得㊂本文对化合物的分离纯化及结构鉴定工作进行报道㊂１㊀材料与方法１．１㊀仪器与试剂ＡＶ－６００型超导核磁共振谱仪，Ｂｒｕｋｅｒ公司；ＮｅｘｅｒａＸ２ＬＣ－３０ＡＤ／８０５０型液相色谱－质谱联用仪，日本岛津公司；ＱｕｉｃｋＳｅｐ－５０半制备液相色谱仪，北京慧德易科技有限责任公司；１２６０分析型液相色谱仪核磁共振仪，美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司；反相ＹＭＣＰａｃｋＯＤＳ－Ａ半制备色谱柱㊁ＹＭＣＰａｃｋＯＤＳ反相填料（５μｍ，２５０ｍｍˑ１０ｍｍ），ＹＭＣ公司；旋转蒸发仪（Ｒ－２１０），瑞士Ｂｕｃｈｉ公司；大容量旋转蒸发仪，Ｈｅｉ－ＶＡＰｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，德国Ｈｅｉｄｏｌｐｈ公司㊂柱层析硅胶，青岛海洋化工厂；ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０，Ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａ⁃ｃｉａｂｉｏｔｅｃｈ，ＡＢ公司㊂色谱用甲醇㊁乙腈，美国ＴＥＤＩＡ试剂公司㊂其余试剂均为国产分析纯㊂１．２㊀生物材料实验菌株分离自２０１５年５月在中国海南儋州洋浦湾磷枪石岛采集的深海泥㊂１６ｓｒＤＮＡ序列测定确定为放线菌Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｓｐ．，命名为ＨＮ－Ｅ３１，菌种现保存于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ＭＣＣＣ１Ｋ０３３２８㊂１．３㊀液体发酵从超低温冰箱（－８０ħ）中取出冻存于３０％甘油的放线菌菌株ＨＮ－Ｅ３１，采用平板划线法连续活化３代㊂挑选单菌落接种于１００ｍＬ的２２１６Ｅ液体培养基（蛋白胨５ｇ，酵母膏１ｇ，磷酸高铁０．０１ｇ，海水１０００ｍＬ，ｐＨ７．６ ７．８，１２１ħ高压蒸汽灭菌２０ｍｉｎ），恒温摇床（２８ħ，１８０ｒ／ｍｉｎ）培养７２ｈ，制备种子液㊂将该种子液按体积分数１％的接种量接种于含２０００ｍＬ２２１６Ｅ液体培养基的三角瓶中，共接种１００Ｌ，在２８ħ㊁１８０ｒ／ｍｉｎ的条件下摇床培养７ｄ，发酵液于１０ħ，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上清液㊂１．４㊀提取分离发酵液上清液用等体积的乙酸乙酯萃取３次，合并３次萃取物，４０ħ下减压浓缩至干后，加入１Ｌ甲醇复溶，过滤，滤液于４０ħ减压浓缩至干，得总萃取物２８．６ｇ㊂取２０ｇ乙酸乙酯萃取物用１００ｍＬ甲醇－乙酸乙酯混合溶剂溶解并上样于ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶柱色谱柱（１５０ｃｍˑ５ｃｍ）中，以甲醇作为洗脱剂，流速为３６ｍＬ／ｈ，洗脱组分用薄层色谱展开并显色（１０％硫酸乙醇），合并斑点相同馏分，共分为５个粗组分（Ａ－Ｅ）㊂㊃７５０１㊃第５期张岗等：海洋来源放线菌ＨＮ⁃Ｅ３１次生代谢产物的分离与鉴定粗组分Ｃ（１１．１ｇ）上ＯＤＳ反相柱色谱（２０ｃｍˑ５ｃｍ）分离，用１０％到１００％浓度的甲醇水溶液梯度洗脱，共分为８个部分（Ｃ１－Ｃ８），Ｃ５（０．１４ｇ）组分经ｓｅｍｉ－ＨＰＬＣ纯化（甲醇ʒ水，１５ʒ８５，１．５ｍＬ／ｍｉｎ）得到化合物１（１２．２ｍｇ）㊁５（２．４ｍｇ）㊁６（２．１ｍｇ）和１２（４．１ｍｇ）；Ｃ７（０．５０ｇ）组分经ｓｅｍｉ－ＨＰＬＣ纯化（甲醇ʒ水，２０ʒ８０，１．５ｍＬ／ｍｉｎ）得到化合物２（４．２ｍｇ）㊁３（３．７ｍｇ）㊁４（３．５ｍｇ）和９（２．８ｍｇ）；Ｃ６（０．０６４ｇ）组分经ｓｅｍｉ－ＨＰＬＣ纯化（甲醇ʒ水，１７ʒ８３，１．５ｍＬ／ｍｉｎ）得到化合物８（３．２ｍｇ）㊁１０（４．１ｍｇ）；Ｃ２组分经ｓｅｍｉ－ＨＰＬＣ纯化（甲醇ʒ水，５ʒ９５，１．５ｍＬ／ｍｉｎ）得到化合物７（３．０ｍｇ）㊂Ｃ１（０．２０ｇ）组分经ｓｅｍｉ－ＨＰＬＣ纯化（ＨｉｌｉｃＳｉｌｉｃａ柱，９８％乙腈，１．５ｍＬ／ｍｉｎ）得到化合物１１（１．４ｍｇ）㊂２　结构鉴定㊀㊀化合物１㊀白色无定形粉末；ＥＳＩ－ＭＳ给出了ｍ／ｚ为１９７．０［Ｍ＋Ｈ］＋的准分子离子峰；ＮＭＲ碳谱和ＤＥＰＴ谱给出了１０个碳信号，包括２个甲基信号δ１７．３㊁１５．５；３个亚甲基信号δ４４．８㊁２１．７㊁２８．７；３个次甲基信号δ６０．５㊁５８．５㊁２８．４，其中前两个碳上可能连结杂原子；２个羰基信号δ１７１．４㊁１６６．６㊂根据核磁和质谱数据，推断分子式为Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ２，确定分子中含有４个不饱合度，并含有双环结构㊂结合１ＨＮＭＲ中显示的δ４．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）㊁４．０４（１Ｈ，ｍ）两个氨基酸a位氢特征信号，推测化合物１为环二肽类物质㊂１３ＣＮＭＲ图谱中１７１．４（ｓ），４４．８（ｔ），２１．７（ｔ），２８．７（ｔ）和６０．５（ｄ）为脯氨酸片段特征信号，而１６６．６（ｓ），５８．５（ｄ），２８．４（ｄ），１７．３（ｑ），１５．５（ｑ）为缬氨酸片段特征信号㊂最后将１的波谱数据与文献数据对比［７］，鉴定化合物１为环（脯－缬）二肽㊂化合物１的波谱数据如下：ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１９７．０［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：３．５７（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ａ），３．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ｂ），１．９２（２Ｈ，ｍ，Ｈ２－４），２．４９（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５ａ），２．３２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５ｂ），４．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－６），４．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－９），２．０３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１０），１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ３－１１），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ３－１２）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１７１．４（ｓ，Ｃ－１），４４．８（ｔ，Ｃ－３），２１．７（ｔ，Ｃ－４），２８．７（ｔ，Ｃ－５），６０．５（ｄ，Ｃ－６），１６６．６（ｓ，Ｃ－７），５８．５（ｄ，Ｃ－９），２８．４（ｄ，Ｃ－１０），１７．３（ｑ，Ｃ－１１），１５．５（ｑ，Ｃ－１２）㊂化合物２㊀白色无定形粉末；ＥＳＩ－ＭＳ给出了ｍ／ｚ为２１１．２［Ｍ＋Ｈ］＋的准分子离子峰；结合１ＨＮＭＲ和１３ＣＮＭＲ数据，推断分子式为Ｃ１１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２，比化合物１多了一个－ＣＨ２－㊂化合物２的波谱数据与１非常相似，比如１ＨＮＭＲ中显示的δ４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）㊁４．１４（１Ｈ，ｍ）氨基酸a位氢特征信号，１３ＣＮＭＲ谱中显示的δ１７１．４（ｓ），４５．１（ｔ），２２．２（ｔ），２７．６（ｔ），５８．７（ｄ）为脯氨酸片段特征信号，此外，１ＨＮＭＲ数据显示了两个双峰甲基信号δ０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），参照文献数据［８］，鉴定化合物为环（脯－亮）二肽㊂化合物２的波谱数据如下：ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ２１１．２［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：３．５１（２Ｈ，ｍ，Ｈ２－３），２．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４ａ），１．９３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４ｂ），２．３０（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５ａ），２．０３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５ｂ），４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－６），４．１４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－９），１．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１０ａ），１．５２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１０ｂ），１．８９（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１１），０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ３－１２），０．９５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ３－１３）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１７１．４（ｓ，Ｃ－１），４５．１（ｔ，Ｃ－３），２２．２（ｔ，Ｃ－４），２７．６（ｔ，Ｃ－５），５８．７（ｄ，Ｃ－６），１６７．５（ｓ，Ｃ－７），５３．２（ｄ，Ｃ－９），３８．１（ｔ，Ｃ－１０），２４．４（ｄ，Ｃ－１１），２２．０（ｑ，Ｃ－１２），２０．８（ｑ，Ｃ－１３）㊂化合物３㊀白色无定形粉末；ＥＳＩ－ＭＳ给出了ｍ／ｚ为２１１．２［Ｍ＋Ｈ］＋的准分子离子峰；结合１ＨＮＭＲ和１３ＣＮＭＲ数据，推断分子式为Ｃ１１Ｈ１８Ｎ２Ｏ２，与化合物２互为同分异构体㊂３的１ＨＮＭＲ谱图中也显示了δ４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）㊁４．１４（１Ｈ，ｍ）氨基酸a位氢特征信号，１３ＣＮＭＲ谱则显示的δ１７２．３（ｓ），４５．０（ｔ），２１．８（ｔ），２８．３（ｔ），５９．７（ｄ）脯氨酸片段特征信号，与化合物２不同的是，其１ＨＮＭＲ数据显示了１个双峰甲基信号δ１．０６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）和１个三峰甲基信号δ０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），与之相吻合的是１３ＣＮＭＲ谱上显示的异亮氨酸片段信号：δ１６６．１（ｓ），５８．５（ｄ），２４．１（ｄ），３５．７（ｄ），１４．２（ｑ），１１．１（ｑ）㊂参照文献数据［７］，鉴定化合物为环（脯－异亮）二肽㊂化合物３的波谱数据如下：ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ２１１．２［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ａ），３．５１（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ｂ），１．９６（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４ａ），１．９２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４ｂ），２．３２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５ａ），２．１７（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５ｂ），４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－６），４．０６（１Ｈ，ｍ，Ｈ－９），２．０３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１０），１．４５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１１ａ），１．３２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１１ｂ），０．９３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ３－１２），１．０６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ３－１３）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１７２．３（ｓ，Ｃ－１），４５．０（ｔ，Ｃ－３），２１．８（ｔ，Ｃ－４），２８．３（ｔ，Ｃ－５），５９．７（ｄ，Ｃ－６），１６６．１（ｓ，Ｃ－７），５８．５（ｄ，Ｃ－９），２４．１（ｄ，Ｃ－１０），３５．７（ｄ，Ｃ－１１），１４．２（ｑ，㊃８５０１㊃㊀江西农业大学学报第４０卷Ｃ－１２），１１．１（ｑ，Ｃ－１３）㊂化合物４㊀白色无定形粉末；ＥＳＩ－ＭＳ给出了ｍ／ｚ为２４５．２［Ｍ＋Ｈ］＋的准分子离子峰；４的１ＨＮＭＲ谱图中显示了单取代苯环特征信号：δ７．１７（２Ｈ，ｍ），７．３０（３Ｈ，ｍ）㊂而δ４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）㊁３．５０（１Ｈ，ｍ）为两个氨基酸a位氢特征信号㊂１３ＣＮＭＲ谱显示了脯氨酸片段特征信号：δ１７１．３（ｓ），４６．４（ｔ），２２．７（ｔ），２９．８（ｔ），６０．０（ｄ）；苯丙氨酸片段特征信号：１６７．７（ｓ），５９．４（ｄ），４１．２（ｄ），１３６．７（ｓ），１２９．６（ｄ），１３１．３（ｄ），１２８．５（ｄ），参照文献数据［９］，鉴定化合物４为环（脯－苯丙）二肽㊂化合物４的波谱数据如下：ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ２４５．２［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：３．２９（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ａ），２．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ｂ），１．６７（２Ｈ，ｍ，Ｈ２－４），２．０３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５ａ），１．８９（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５ｂ），４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－６），３．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ－９），３．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４，４．８Ｈｚ，Ｈ－１０ａ），２．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７，４．８Ｈｚ，Ｈ－１０ｂ），７．１７（２Ｈ，ｍ，Ｈ－２ᶄ，６ᶄ），７．３０（３Ｈ，ｍ，Ｈ－３ᶄ，４ᶄ，５ᶄ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１７１．３（ｓ，Ｃ－１），４６．４（ｔ，Ｃ－３），２２．７（ｔ，Ｃ－４），２９．８（ｔ，Ｃ－５），６０．０（ｄ，Ｃ－６），１６７．７（ｓ，Ｃ－７），５９．４（ｄ，Ｃ－９），４１．２（ｄ，Ｃ－１０），１３６．７（ｓ，Ｃ－１ᶄ），１２９．６（ｄ，Ｃ－２ᶄ，６ᶄ），１３１．３（ｄ，Ｃ－３ᶄ，５ᶄ），１２８．５（ｄ，Ｃ－４ᶄ）㊂化合物５㊀白色无定形粉末；化合物５的１ＨＮＭＲ谱图中显示了δ３．９９（１Ｈ，ｍ）㊁３．９５（１Ｈ，ｍ）两个氨基酸a位氢特征信号，３个双峰甲基信号：δ０．９９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．４５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）㊂１３ＣＮＭＲ谱显示了亮氨酸片段特征信号：δ１７１．３（ｓ），５１．９（ｄ），４５．１（ｔ），２５．３（ｄ），２３．５（ｑ），２２．１（ｑ）；丙氨酸片段特征信号：１７１．０（ｓ），５４．６（ｄ），２０．９（ｑ），结合ＥＳＩ－ＭＳ给出的ｍ／ｚ为１８５．２［Ｍ＋Ｈ］＋的准分子离子峰，并参照文献数据［１０］，鉴定化合物５结构为环（亮－丙）二肽㊂化合物波谱数据：ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１８５．２［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：３．９９（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２），１．７４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ａ），１．６４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ｂ），１．８５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４），４．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－６），０．９９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ３－５），０．９７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ３－６），３．９５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２ᶄ），１．４５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ３－３ᶄ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１７１．３（ｓ，Ｃ－１），５１．９（ｄ，Ｃ－２），４５．１（ｔ，Ｃ－３），２５．３（ｄ，Ｃ－４），２３．５（ｑ，Ｃ－５），２２．１（ｑ，Ｃ－６），１７１．０（ｓ，Ｃ－１ᶄ），５４．６（ｄ，Ｃ－２ᶄ），２０．９（ｑ，Ｃ－３ᶄ）㊂化合物６㊀ＥＳＩ－ＭＳ给出了ｍ／ｚ为１８５．２［Ｍ＋Ｈ］＋的准分子离子峰；结合１ＨＮＭＲ和１３ＣＮＭＲ数据，推断分子式为Ｃ９Ｈ１６Ｎ２Ｏ２，与化合物５互为同分异构体㊂核磁数据显示，化合物６与５结构非常相似，最大区别为６中含有两个双峰甲基δ１．０２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）㊁１．４４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）和１个三峰甲基０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），而１３ＣＮＭＲ谱显示了异亮氨酸片段特征信号：δ１７１．３（ｓ），５１．７（ｄ），４０．３（ｄ），２５．６（ｔ），１２．２（ｑ），１５．６（ｑ）㊂参照文献数据［１０］，鉴定化合物６为环（异亮－丙）二肽㊂化合物６的波谱数据如下：ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１８５．２［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：４．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２），１．９５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３），１．５４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４ａ），１．２６（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４ｂ），０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ３－５），１．０２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ３－６），３．９０（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２ᶄ），１．４４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ３－３ᶄ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１７１．３（ｓ，Ｃ－１），５１．７（ｄ，Ｃ－２），４０．３（ｄ，Ｃ－３），２５．６（ｔ，Ｃ－４），１２．２（ｑ，Ｃ－５），１５．６（ｑ，Ｃ－６），１６９．２（ｓ，Ｃ－１ᶄ），６０．９（ｄ，Ｃ－２ᶄ），２０．９（ｑ，Ｃ－３ᶄ）㊂化合物７㊀茚三酮反应显阳性㊂ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１６４．２［Ｍ－Ｈ］－；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：７．３３（４Ｈ，ｍ，Ｈ－２ᶄ，Ｈ－３ᶄ，Ｈ－５ᶄ，Ｈ－６ᶄ），７．２３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４ᶄ），３．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，４．２Ｈｚ，Ｈ－２），３．３１（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３ｂ），２．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．４，９Ｈｚ，Ｈ－３ｂ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１７３．７（ｓ，Ｃ－１），１３７．３（ｓ，Ｃ－１ᶄ），１３０．４（ｄ，Ｃ－２ᶄ，６ᶄ），１３０．０（ｄ，Ｃ－３ᶄ，５ᶄ），１２８．４（ｄ，Ｃ－４ᶄ），５７．９（ｄ，Ｃ－２），３８．３（ｔ，Ｃ－３）㊂以上波谱数据与李雯等人［１１］的报道一致，鉴定化合物７为苯丙氨酸㊂化合物８㊀白色无定形粉末㊂１ＨＮＭＲ中显示δ８．２０（１Ｈ），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．２２（２Ｈ，ｍ）一组芳香质子信号以及一个亚甲基信号δ４．６９㊂１３ＣＮＭＲ谱显示了８个不饱和碳骨架信号：１３８．２（ｓ），１３４．０（ｄ），１２６．９（ｓ），１２４．４（ｄ），１２３．３（ｄ），１２２．７（ｄ），１１４．９（ｓ）和１１２．９（ｄ），结合氢谱数据推测８为吲哚生物碱类衍生物，另外，碳谱上还显示一个羰基信号δ１９５．９和一个亚甲基信号δ６６．３㊂ＨＭＢＣ谱中显示δ４．６９的亚甲基信号分别与羰基碳（δ１９５．９）和吲哚环３位碳（δ１１４．９）相关，吲哚环２位氢（δ８．２０）则分别与羰基碳㊁吲哚环３位碳（δ１１４．９）以及吲哚环３ａ位碳（δ１２６．９）信号相关，表明羰基碳连接在吲哚环３位，且旁边连有亚甲基，结合ＥＳＩ－ＭＳ给出的ｍ／ｚ１７４．２［Ｍ－Ｈ］－１信号并与文献波谱数据［１２⁃１３］对比，鉴定化合物８为３－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｙｌ－ｉｎｄｏｌｅ㊂ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１７４．２［Ｍ－Ｈ］－１；１ＨＮＭＲ第５期张岗等：海洋来源放线菌ＨＮ⁃Ｅ３１次生代谢产物的分离与鉴定（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：８．２０（１Ｈ，ｓ，Ｈ－２），８．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ－４），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ－７），７．２２（２Ｈ，ｍ，Ｈ－５，Ｈ－６），４．６９（ｔ，２Ｈ，Ｈ２－９）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１９５．９（ｓ，Ｃ－８），１３８．２（ｓ，Ｃ－７ａ），１３４．０（ｄ，Ｃ－２），１２６．９（ｓ，Ｃ－３ａ），１２４．４（ｄ，Ｃ－６），１２３．３（ｄ，Ｃ－５），１２２．７（ｄ，Ｃ－４），１１４．９（ｓ，Ｃ－３），１１２．９（ｄ，Ｃ－７），６６．３（ｔ，Ｃ－９）㊂化合物９㊀白色无定形粉末㊂ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１４４．１［Ｍ－Ｈ］－１；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：９．８９（１Ｈ，ｓ，Ｈ－８），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ－７），８．１０（１Ｈ，ｓ，Ｈ－２），７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ－４），７．２４（２Ｈ，ｍ，Ｈ－５，Ｈ－６）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１８６．０（ｄ，Ｃ－８），１３８．３（ｄ，Ｃ－２），１３７．５（ｓ，Ｃ－７ａ），１２４．３（ｓ，Ｃ－３ａ），１２３．６（ｄ，Ｃ－６），１２２．２（ｄ，Ｃ－５），１２１．０（ｄ，Ｃ－４），１１８．７（ｓ，Ｃ－３），１１１．７（ｄ，Ｃ－７）㊂以上波谱数据与袁莉等［１４］的报道一致，鉴定化合物９为３－吲哚甲醛㊂化合物１０㊀白色结晶性粉末，三氯化铁反应显阳性，提示分子内含有酚羟基㊂ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１３７．１［Ｍ－Ｈ］－；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ－６），７．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ－４），６．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ－３），６．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－５）；以上波谱数据与贾陆等［１５］的报道一致，鉴定化合物１０为水杨酸㊂化合物１１㊀ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１１７．１［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：５．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－５），７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－６）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１５１．３（ｓ，Ｃ－２），１６４．２（ｓ，Ｃ－４），１００．４（ｄ，Ｃ－５），１４２．８（ｄ，Ｃ－６）㊂以上波谱数据与邹峥嵘等［１６］的报道一致，鉴定化合物１１为尿嘧啶㊂化合物１２㊀白色结晶性粉末㊂ＥＳＩ－ＭＳｍ／ｚ１２１．１［Ｍ＋Ｈ］＋；１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δ：９．７６（１Ｈ，ｓ，－ＣＨＯ），７．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ－２，６），６．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ－３，５）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δ：１９２．９（ｓ，－ＣＨＯ），１６５．２（ｓ，Ｃ－４），１３３．５（ｄ，Ｃ－２，６），１３０．２（ｓ，Ｃ－１），１１６．９（ｄ，Ｃ－３，５）㊂以上波谱数据与郑丽花等［１７］的报道一致，鉴定化合物１２为对羟基苯甲醛㊂图１㊀化合物１－１２的分子结构Ｆｉｇ．１㊀Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄｓ１－１２３　结论与讨论㊀㊀从采自中国南海的鸟氨酸微菌属放线菌Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｓｐ．（ＨＮ－Ｅ３１）的发酵液中首次分离获得１２个化合物，包括６个环二肽类物质（１ ６），１个氨基酸（７），２个吲哚生物碱（８，９），１个酚酸类化合物（１０），１个核苷酸类化合物（１１），１个芳香醛类化合物（１２）㊂诸多报道证实，本研究中所得的部分化合物具有抑制病原微生物生长活性㊂化合物１－４对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有弱抑菌活性，ＭＩＣ值分别在７．２ １８．８μｇ／ｍＬ和８．７ １８．２μｇ／ｍＬ［１８］㊂化合物１－４还对鳗弧菌有强烈的抑菌活性（ＭＩＣ：０．０３ ０．１４μｇ／ｍＬ），该活性的表达要求抗菌环二肽中应至少存在一个Ｄ型氨基酸残基［１９］㊂化合物１㊁４和１１对五种海洋污损细菌具有选择性的抑菌活性［２０］㊂化合物２对耐万古霉素肠球菌有抑菌作用［２１］㊂化合物３对稻瘟霉有抑制活性，ＭＩＣ值为４．８μｇ／ｍＬ［２２］㊂化合物１２对白念珠菌和㊃９５０１㊃㊃０６０１㊃㊀江西农业大学学报第４０卷金黄色葡萄球菌显示了弱抑菌作用［２３］并在体外显示微弱的选择性抗疟活性［２４］㊂化合物９对大肠杆菌显示了中等强度的抑制活性［２５］㊂这些研究报道结果与ＨＮ－Ｅ３１发酵液的抑菌活性有一定的关联性，笔者将继续关注所得化合物的抑菌活性㊂本研究丰富了对鸟氨酸微菌属放线菌次生代谢产物数量和种类的认识，对该菌株的后续开发应用提供依据㊂致谢：厦门大学药学院孙翠玲老师代测化合物ＮＭＲ图谱数据，谨致谢意！参考文献：［１］周世水，丁金国，姚汝华．海洋微生物药物的开发和应用［Ｊ］．工业微生物，２００２，３２（２）：４８⁃５１．ＺｈｏｕＳＳ，ＤｉｎｇＪＧ，ＹａｏＲＨ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｒｉｎｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｄｒｕｇｓ［Ｊ］．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，３２（２）：４８⁃５１．［２］刘妍，李志勇．海洋放线菌研究的新进展［Ｊ］．生物技术通报，２００５（６）：３４⁃３９．ＬｉｕＹ，ＬｉＺＹ．Ｎｅｗｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｍａｒｉｎｅａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ，２００５（６）：３４⁃３９．［３］ＲａｍａｐｒａｓａｄＥＶ，ＣｈＳ，ＣｈｖＲ．Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍａｌｇｉｃｏｌａｓｐ．ｎｏｖ．ａｍａｒｉｎｅａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｇｒｅｅｎａｌｇａｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＵｌｖａ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ＆ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，６５（１２）：４６２７⁃４６３１．［４］ＧｒｏｔｈＩ，ＳｃｈｕｍａｎｎＰ，ＷｅｉｓｓＮ，ｅｔａｌ．Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｈｕｍｉｐｈｉｌｕｍｇｅｎ．ｎｏｖ．ｓｐ．ｎｏｖ．ａｎｏｖｅｌｓｏｉｌａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｗｉｔｈＬ⁃ｏｒ⁃ｎｉｔｈｉｎｅｉｎｔｈｅｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ＆ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，５１（１）：８１⁃８７．［５］王保军，刘缨，姜嘉彤，等．蝎子肠道内微生物多样性研究［Ｊ］．微生物学报，２００７，４７（５）：８８８⁃８９３．ＷａｎｇＢＪ，ＬｉｕＹ，ＪｉａｎｇＪＴ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｓｃｏｒｐｉｏｎｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉｉＫａｒｓｃｈ）［Ｊ］．ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ⁃ｃａＳｉｎｉｃａ，２００７，４７（５）：８８８⁃８９３．［６］ＦａｎｇＸＭ，ＹａｎＤ，ＢａｉＪＬ，ｅｔａｌ．Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍｆｌａｖｕｍｓｐ．ｎｏｖ．ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｌｅａｆｏｆＰａｒｉｓｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａ⁃ｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７，６７（１１）：４５４１⁃４５４５．［７］林己，林秀萍，艾文，等．深海放线菌Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａｓｐ．０１１１９的代谢产物研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，２０１４，２６（７）：１０２６⁃１０２９．ＬｉｎＪ，ＬｉｎＸＰ，ＡｉＷ，ｅｔａｌ．ＳｔｕｄｙｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｆｒｏｍａｄｅｅｐｓｅａａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓｔｒａｉｎＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａｓｐ．０１１１９［Ｊ］．ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＲｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１４，２６（７）：１０２６⁃１０２９．［８］林真亭，叶子坚，庄玲萍，等．一株海洋放线菌抗菌活性物质的分离与结构解析［Ｊ］．江西农业大学学报，２０１７，３９（３）：５５９⁃５６６．ＬｉｎＺＴ，ＹｅＺＪ，ＺｈａｎｇＬＰ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｆｒｏｍａｍａｒｉｎｅａｔｉｎｏ⁃ｍｙｃｅｔｅｓｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＪｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ，２０１７，３９（３）：５５９⁃５６６．［９］吕海宁，陈辉，屈晶，等．内生真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ次生代谢产物研究［Ｊ］．中国现代中药，２０１５，１７（５）：４２７⁃４３０．ＬüＨＮ，ＣｈｅｎＨ，ＱｕＪ，ｅｔａｌ．ＳｔｕｄｙｏｎｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ［Ｊ］．ＭｏｄｅｒｎＣｈｉ⁃ｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，１７（５）：４２７⁃４３０．［１０］韩冰，李文欣，崔承彬．黄直丝链霉菌１８５２２生产的环二肽类细胞周期抑制剂［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２０１５，３２（２）：１０７⁃１１０．ＨａｎＢ，ＬｉＷＸ，ＣｕｉＣＢ．ＣｙｃｌｉｃｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓａｓｎｅｗｃｅｌｌｃｙｃｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｌａｖｏｒｅｔｕｓ１８５２２［Ｊ］．Ｊｏｕ⁃ｎａｌｏｆＳｈｅｎｙａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１５，３２（２）：１０７⁃１１０．［１１］李雯，王国才，张晓琦，等．中药壁虎化学成分研究［Ｊ］．中国中药杂志，２０１０，３５（１８）：２４１２⁃２４１５．ＬｉＷ，ＷａｎｇＧＣ，ＺｈａｎｇＸＱ，ｅｔａｌ．ＣｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＧｅｋｋｏｓｗｉｎｈｏｎｉｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎａＪｏｕｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，２０１０，３５（１８）：２４１２⁃２４１５．［１２］ＤｉｌｌｍａｎＲＬ，ＩｉＪＨＣ．ＡｒｏｍａｔｉｃｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｆｒｏｍｔｈｅｓｐｏｎｇｅＴｅｄａｎｉａｉｇｎｉｓ［Ｊ］．ＪｏｕｎａｌｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，１９９１，５４（４）：１０５６⁃１０６１．［１３］谢萌，熊子君，赵立兴，等．雷公藤植物内生Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｓｐ．Ｍ６６生产的一组吲哚生物碱［Ｊ］．微生物学通报，２０１６，４３（１）：５１⁃５９．ＸｉｅＭ，ＸｉｏｎｇＺＪ，ＺｈａｏＬＸ，ｅｔａｌ．ＩｎｄｏｌｅａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｓｐ．Ｍ６６ｏｆＴｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍｗｉｌｆｏｒｄｉｉＨｏｏｋ．ｆ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＣｈｉｎａ，２０１６，４３（１）：５１⁃５９．㊃１６０１㊃第５期张岗等：海洋来源放线菌ＨＮ⁃Ｅ３１次生代谢产物的分离与鉴定［１４］袁莉，汤华，孙鹏，等．中国南海海绵Ｉｏｔｒｏｃｈｏｔａｓｐ．的化学成分研究［Ｊ］．中国海洋药物，２０１６，３５（４）：１１⁃１５．ＹｕａｎＬ，ＴａｎｇＨ，ＳｕｎＰ，ｅｔａｌ．ＣｈｅｍｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｔｈｅＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＳｅａＳｐｏｎｇｅＩｏｔｒｏｃｏｔａｓｐ．［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｒｉｎｅＤｒｕｇｓ，２０１６，３５（４）：１１⁃１５．［１５］贾陆，郭海波，敬林林，等．地桃花化学成分研究．Ⅱ．酚酸类等化学成分［Ｊ］．中国医药工业杂志，２００９，４０（１０）：７４６⁃７４９．ＪｉａＬ，ＧｕｏＨＢ，ＪｉｎｇＬＬ，ｅｔａｌ．ＳｔｕｄｙｏｎｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＵｒｅｎａｌｏｂａｔａＬ．Ⅱ．ｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２００９，４０（１０）：７４６⁃７４９．［１６］邹峥嵘，易杨华，姚新生，等．海地瓜化学成分研究［Ｊ］．中国天然药物，２００４，２（６）：３４８⁃３５０．ＺｏｕＺＲ，ＹｉＹＨ，ＹａｏＸＳ，ｅｔａｌ．ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＡｃａｕｄｉｎａｍｏｌｐａｄｉｏｉｄｅｓＳｅｍｐｅｒ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒａｌＭｅｄｉｃｉｎｅｓ，２００４，２（６）：３４８⁃３５０．［１７］郑丽花，李小宝，宋鑫明，等．狭叶栀子茎化学成分研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，２０１２，２４（１０）：１３８２⁃１３８４．ＺｈｅｎｇＬＨ，ＬｉＸＢ，ＳｏｎｇＸＭ，ｅｔａｌ．ＳｔｕｄｙｏｎｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｒｏｍｓｔｅｍｓｏｆＧａｒｄｅｎｉａｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａＭｅｒｒ［Ｊ］．ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＲｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１２，２４（１０）：１３８２⁃１３８４．［１８］Ｅｌ－ＧｅｎｄｙＥＤＭ，ＲａｔｅｂＭＥ．Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｍａｒｉｎｅｆｕｎｇｕｓｕｓｉｎｇｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒ⁃ｂｏｎｙｌｇｒｏｕｐａｓａｓｉｍｐｌｅｔｏｏｌｆｏｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０１５，２５（１６）：３１２５⁃３１２８．［１９］ＦｄｈｉｌａＦ，ＶáｚｑｕｅｚＶ，ＳáｎｃｈｅｚＪＬ，ｅｔａｌ．ＤＤ⁃Ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｓ：ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓａｃｔｉｖｅａｇａｉｎｓｔＶｉｂｒｉｏａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｍａｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉａａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｐｅｃｔｅｎｍａｘｉｍｕｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，２００３，６６（１０）：１２９９⁃１３０１．［２０］ＱｉＳＨ，ＸｕＹ，ＧａｏＪ，ｅｔａｌ．ＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄａｎｔｉｌａｒｖａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｆｒｏｍｍａｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，５９（２）：２２９⁃２３３．［２１］ＲｈｅｅＫＨ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐＫＨ⁃６１４ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｔｉ⁃ＶＲＥ（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌ＆ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，４８（６）：３２１⁃３２７．［２２］韩文菊，卢小玲，许强芝，等．海洋芽孢杆菌次生代谢产物的分离㊁鉴定及生物学活性的初步研究［Ｊ］．第二军医大学学报，２００８，２９（１０）：１２３４⁃１２３８．ＨａｎＷＪ，ＬｕＸＬ，ＸｕＱＺ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙａｍａｒｉｎｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｊ］．ＡＣａｄｅｍｉｃＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８，２９（１０）：１２３４⁃１２３８．［２３］ＢｏｕａｉｃｈａＮ，ＡｍａｄｅＰ，ＰｕｅｌＤ，ｅｔａｌ．Ｚａｒｚｉｓｓｉｎｅ，ａｎｅｗｃｙｔｏｔｏｘｉｃｇｕａｎｉｄｉｎｅａｌｋａｌｏｉｄｆｒｏｍｔｈｅＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎｓｐｏｎｇｅＡｎｃｈｉｎｏｅｐａｕｐｅｒｔａｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，１９９４，５７（１０）：１４５５⁃１４５７．［２４］ＷｒｉｇｈｔＡＤ，ＫöｎｉｇＧＭ，ＡｎｇｅｒｈｏｆｅｒＣＫ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ：ｔｈｅｓｅａｒｃｈｆｏｒｍａｒｉｎｅ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈｓｅ⁃ｌｅｃｔｉｖｅａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，１９９６，５９（７）：７１０⁃７１６．［２５］ＰｅｎｇＹ，ＨｕａｎｇＲ，ＨｕＪ，ｅｔａｌ．ＢｉｏａｃｔｉｖｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆｔｈｅＳｏｕｔｈＣｈｉｎａｓｅａｓｔａｒｆｉｓｈＳｔｅｌｌａｓｔｅｒｅｑｕｅｓｔｒｉｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｓ⁃ｔｒｙｏｆＮａｔｕｒａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｓ，２０１４，５０（１）：１８４⁃１８５．。

海洋放线菌BM_2菌株抗真菌活性物质的分离纯化与结构
鉴定_马桂珍
研究开始时，研究人员首先对菌株进行了鉴定和培养。

通过形态学观
察和生物化学特性的分析，确定菌株为海洋放线菌BM_2、接下来，研究
人员从菌株的发酵产物中提取了目标活性物质。

提取后的发酵产物经过一系列的色谱分离步骤，包括正相色谱、反相
色谱和凝胶渗透色谱等。

每一次分离步骤后，研究人员都进行了活性检测，以确定目标物质的分离纯度和活性。

分离纯化的目标物质随后进行了进一步的结构鉴定。

研究人员利用核
磁共振波谱（NMR）和质谱技术，确定了目标物质的分子式和分子结构。

通过与已知类似化合物进行比对，他们还确定了目标物质的可能分类和结
构类型。

在结构鉴定的基础上，研究人员对目标物质进行了进一步的生物活性
测试。

他们使用不同的真菌菌株进行了抗菌活性实验，并对目标物质的最
小抑菌浓度（MIC）进行了测定。

通过这些实验，他们发现目标物质对一
些真菌菌株具有较强的抗菌活性，并且可以抑制真菌的生长和繁殖。

总结来说，这项研究利用海洋放线菌BM_2菌株分离纯化了一类具有
抗真菌活性的活性物质，并进行了结构鉴定和生物活性测试。

这项研究结
果对于进一步深入了解这些活性物质的药理作用和开发相关抗真菌药物具
有重要意义。

海洋真菌Penicillium citrinum MNP12010101代谢产物的分离鉴定和活性研究王鸿;潘超;周峰;赵美蓉【摘要】对海洋真菌桔青霉Penicillium citrinum MNP12010101的发酵液乙酸乙酯萃取部分进行化学研究,采用硅胶,Sephedax LH-20,ODS柱色谱和制备高效液相色谱进行分离和纯化,经过各种光谱方法鉴定,得到7个化合物,其中化合物Ⅴ为首次从自然界分离得到,其活性也属首次报道,化合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ均为首次从该菌种中分离得到.在进行活性测定时发现,化合物Ⅰ和Ⅲ有较好的细胞毒性;化合物Ⅲ具有较强的胰蛋白酶抑制活性;化合物Ⅰ,Ⅲ,Ⅴ,Ⅵ表现出较高的DPPH清除率.【期刊名称】《浙江工业大学学报》【年(卷),期】2014(042)004【总页数】5页(P409-412,439)【关键词】海洋真菌;抗肿瘤;抗氧化;胰蛋白酶【作者】王鸿;潘超;周峰;赵美蓉【作者单位】浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310014【正文语种】中文【中图分类】R282.77由于海洋高盐，高压，缺氧等特殊环境的存在，使得海洋真菌产生了一套特殊的代谢途径，从而生成了结构复杂，具有高生物活性的代谢产物[1].自第一个具有抗菌活性化合物cephalosporin C被发现以来，海洋真菌天然代谢产物的研究蓬勃发展，不断受到科研人员的重视，成为了获得先导化合物的主要来源[2-3].海洋真菌Penicillium citrinum MNP12010101分离自中国东海海水(北纬28.25°、东经122.60°海域).从其发酵液的乙酸乙酯中分离得到7个化合物，通过1H-NMR，13C-NMR，IR，ESI-MS以及文献对照方法，鉴定为熊果酸(Ⅰ)，D-阿洛糖(Ⅱ)，Phenol A(Ⅲ)，环(异亮-缬)二肽(Ⅳ)，青霉素K(Ⅴ)，7-乙酰氧基-5-甲氧基-6-甲酰基-2-乙基香豆素(Ⅵ)，6,8-二羟基-3,4,5-三甲基-1-氧异香豆素-7-羧酸(Ⅶ).1 实验部分1.1 菌种来源本实验菌株于2012年在东海海水中分离得到，由南京金斯瑞生物科技公司鉴定为桔青霉Penicillium citrinum.菌种保藏于中国典型培养物保藏中心.1.2 仪器和材料LC-20AT高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；Spectra Max M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Luna 5u C-18制备色谱柱(美国Phenomenex公司)；Autospect 3000质谱仪(美国Thermo公司)；AVANCEH Ⅲ核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)；Revco Elite II CO2培养箱(美国Thermo 公司)；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)购自百灵威公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司；改良型RPMI1640细胞培养基购自奥赛飞世尔生物化学制品有限公司；胰蛋白酶购自上海生工生物有限公司；其余试剂为国产分析纯.前列腺癌细胞PC-3，胰腺癌细胞PANC-1来自浙江工业大学生物与环境工程学院毒理实验室.1.3 桔青霉Penicillium citrinum MNP12010101的发酵培养与活性化合物Ⅰ-Ⅶ的分离将该菌株摇床培养7 d后，静置培养14 d，所得发酵液经过提取和萃取后，得到发酵液浸膏25 g.用甲醇溶解样品，以甲醇和水为流动相梯度洗脱，经大孔树脂粗分为A(20%),B(40%),C(60%),D(80%),E(100%)段，由于该乙酸乙酯萃取物具有抗肿瘤和抑制胰蛋白酶活性，所以文献[4]中活性导向分离技术分别测定各段活性，在活性指导下完成分离纯化：经过反复硅胶柱，ODS柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱色谱和制备液相等方法分离纯化得到化合物Ⅰ(4 mg)、化合物Ⅱ(8 mg)、化合物Ⅲ(35 mg)、化合物Ⅳ(5 mg)、化合物Ⅴ(38 mg)、化合物Ⅵ(3 mg)和化合物Ⅶ(230 mg).2 结果和讨论2.1 活性导向分离结果由表1可以看出：在一直PC-3和PANC-1肿瘤细胞活性的测定中C段和D段的活性明显高于其他分段，其IC50值分别为139,127 μg/mL和155,135 μg/mL；而在胰蛋白酶抑制活性测定中，E段活性虽然略高于C段和D段，但是其抗肿瘤活性不高，所以根据活性导向分析技术，优先分离C段和D段，在C段中获得化合物1,2,4,5,7;在D段中分离得到化合物3,6.表1 各段对PC-3和PANC-1细胞的IC50以及胰蛋白酶抑制活性1)Table 1 IC50 value of each fragment against PC-3 and PANC-1 and their inhibition rate of trypsin化合物ABCDE紫杉醇PC-3/(μg·mL-1)273±1.41∗∗291±1.59∗∗139±1.11∗127±1.01∗195±1.95∗1.87±1.27PANC-1/(μg·mL-1)307±1.62∗∗299±2.01∗∗155±1.34∗135±1.69∗212±1.87∗∗12.96±1.34抑制率/%-3.39±0.1332.76±1.0136.76±1.2537.61±1.52-注:1) n=3,x±s；与紫杉醇对照组比较,*为P<0.05,**为P<0.01.2.2 结构鉴定化合物Ⅰ为淡黄色粉末(甲醇)，分子式为C30H48O3.Lieberman-Burchard反应和10%的硫酸乙醇反应均呈阳性，提示为三萜类化合物.1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.13(1H，t，J=3.6 Hz，H-12)；3.43(1H，dd，J=13.8，7.2 Hz，H-3)；2.10(1H，d，J=10.8 Hz，H-18)；0.68(3H，s)，0.75(3H，s)，0.82(3H，d，J=6.6 Hz)，0.87(3H，s)，0.90(3H，s)，δ0.91(3H，s)，δ1.04(3H，s).13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：38.5(C-1)，26.6(C-2)，78.6(C-3)，39.3(C-4)，55.1(C-5)，23.1(C-6)，32.9(C-7)，41.9(C-8)，47.4(C-9)，16.7(C-10)，18.1(C-11)，125.3(C-12)，138.0(C-13)，47.6(C-14)，27.8(C-15)，24.1(C-16)，48.0(C-17)，52.7(C-18)，38.9(C-19)，38.7(C-20)，30.5(C-21)，36.7(C-22)，27.8(C-23)，15.2(C-24)，15.4(C-25)，27.8(C-26)，23.3(C-27)，178.8(C-28)，24.0(C-29)，20.8(C-30).经文献查阅，上述数据与文献[5]基本一致，故鉴定化合物Ⅰ为熊果酸(Ursolic acid).化合物Ⅱ为白色结晶(甲醇)，分子式为C6H12O6.1H-NMR(500 MHz，D2O)δ：3.23(m,1H,CH2-6)，3.45(m,1H,CH2-6)，3.53(m,1H,CH2-5)，3.59(m,1H,CH-4)，3.68(m,1H,CH-3)，3.96(m,1H,CH-2)，4.70(m,1H,CH-1).13C-NMR(125 MHz，D2O)δ：65.76(C-6)，71.84(C-2)，73.40(C-5)，98.13(C-1).经文献查阅，与文献[6]基本一致，故确定化合物Ⅱ为D-阿洛糖(D-Allose).化合物Ⅲ为黄色油状(甲醇)，分子式为C11H16O3.1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.28(1H,d,J=1.8 Hz,H-6)，6.18(1H,d,J=2.0 Hz,H-4)，3.86(1H,dq,J=6.2 Hz,6.3,H-3)，3.06(1H,dq,J=6.8 Hz,6.9,H-2′)，2.08(3H,s,CH3-2)，1.14(3H,d,J=7.8 Hz,H-1)，1.12(3H,d,J=7.2 Hz,H-4).13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:157.0(s,C-3)，156.3(s,C-5)，145.8(s,C-1)，115.4(s,C-2)，106.0(d,C-6)，101.3(d,C-4)，72.1(d,C-3)，43.1(d,C-2)，19.6(q,C-4)，16.5(q,C-1)，10.9(q,2-CH3).经文献查阅，上述数据与文献[7]一致，故鉴定化合物Ⅲ为Phenol A.化合物Ⅳ为白色粉末(甲醇)，分子式为C11H20N2O2.1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ：4.16(IH,m,H-2)，1.89(IH,m,H-3)，1.17(3H,d,J=6.0 Hz,H-4)，1.64(2H,m,H-5)，0.92(3H,t,H-6)，2.18(1H,m,H-8)，3.79(IH,m,H-9)，0.82(3H,d,J=5.0 Hz,H-10)，0.79(3H,d,J=6.0 Hz,H-11)，13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ：169.5(C-1)，60.2(C-2)，38.9(C-3)，14.8(C-4)，24.2(C-5)，10.8(C-6)，171.1(C-7)，67.4(C-8)，32.3(C-9)，18.4(C-10)，16.7(C-11).经文献查阅，上述数据与文献[8]基本一致，故鉴定化合物Ⅳ为环(异亮-缬)二肽.化合物Ⅴ为白色结晶(甲醇)，分子式为C16H17KN2O4S.1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.35(d,5H,H-2′-H-6),4.21(1H,s,H-3),5.49(1H,s,H-5),5.42(1H,s,H-6),1.48(3H,s,H-9),1.57(3H,s,H-10),3.68(2H,d,H16a,H16b).经查阅文献，上述数据与文献[9]一致，故鉴定化合物Ⅴ为青霉素K.化合物Ⅵ为无色油状(甲醇)，分子式为C15H14O6.1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ：9.55(1H,s,H-13)，7.40(1H,s,d,J=3.5 Hz,H-3)，6.77～6.23(1H,m,H-8)，4.57(1H,d,J=63.0 Hz,)，3.76～3.66(3H,m,H-5)，2.66～2.56(2H,m,H-10)，1.23～1.13(3H,m,H-11).13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ：14.4(C-11)，22.3(C-10)，62.3(C-12)，107.7(C-8)，112.0(C-2)，114.0(C-4)，114.5(C-6)，140.8(C-3)，154.2(C-7)，160.7(C-5)，163.1(C-9)，169.0(C-14).经文献[10]查阅和数据分析，鉴定化合物Ⅵ为7-乙酰氧基-5-甲氧基-6-甲酰基-2-乙基香豆素.化合物Ⅶ为白色粉末(甲醇)，分子式为C13H14O6.1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ：4.53(1H,q,H-9)，3.05(1H,q,H-10)，2.04(3H,s,H-13)，1.19(3H,d,H-12)，1.24(3H,d,H-11).13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ：177.957(C-1)，168.514(C-4)，166.555(C-2)，165.781(C-3)，148.227(C-5)，113.76(C-6)，103.773(C-8)，101.697(C-7)，79.558(C-9)，36.86(C-10)，20.917(C-11)，20.348(C-12)，10.882(C-13).经文献查阅，上述数据与文献[11]基本一致，故鉴定化合物Ⅶ为6,8-二羟基-3,4,5-三甲基-1-氧异香豆素-7-羧酸.化合物Ⅰ—Ⅶ的结构式分别为2.3 化合物活性测定2.3.1 体外抗癌活性研究运用MTT[12]法测定分离得到的单体化合物的抗肿瘤活性，结果如表2所示.从表2中可以看出：所有分离得到的化合物对PC-3和PANC-1细胞均有一定的细胞毒活性，其中熊果酸(Ⅰ)和Phenol A(Ⅲ)的活性相对最强，熊果酸(Ⅰ)对PANC-1的抑制活性好于PC-3，而Phenol A(Ⅲ)则是对PC-3的抑制活性高于PANC-1.2.3.2 胰蛋白酶和抗氧化活性测定根据文献[13-14]提供的方法测定各单体化合物的胰蛋白酶活性和抗氧化活性，结果如表3,4所示.从表3中可以看出：所有的化合物对胰蛋白酶均有一定的抑制活性，并且成一定的浓度依赖关系，但是抑制率普遍较低，只有化合物Phenol A(Ⅲ)在质量浓度为100 μg/mL时，抑制率能达到40%.而在抗氧化活性方面,与阳性对照相比，除化合物Ⅳ和Ⅶ，其余化合物均有较好的抗氧化活性，并且表现出一定的浓度依赖关系.据查文献发现，化合物Ⅶ抗氧化活性较低的原因是与其苯环上羟基处于间位的空间结构相关[15].表2 各化合物对PC-3和PANC-1肿瘤细胞的IC501)Table 2 IC50 value of compounds against PC-3 and PANC-1 μg/mL化合物Ⅰ化合物Ⅱ化合物Ⅲ化合物Ⅳ化合物Ⅵ化合物Ⅶ紫杉醇86.75±0.11∗192.33±0.15∗∗11.43±1.71∗203.41±1.09∗∗165.72±1.61∗∗286.7 9±2.01∗∗1.63±2.5323.12±1.13∗880.59±3.97∗∗35.08±1.92∗242.75±1.15∗∗215.15±1.79∗∗179.94±2.08∗∗10.56±1.98注:1) n=5,x±s；与紫杉醇对照组比较，*为P<0.05,**为P<0.01.表3 各化合物对胰蛋白酶的抑制率Table 3 The inhibition rate of trypsin of the compounds质量浓度/(μg·mL-1)6.2512.52550100化合物Ⅰ/%-12.53±1.4117.77±1.4323.12±1.1825.31±1.15化合物Ⅱ/%6.35±1.1911.64±1.1113.66±1.1337.63±1.1334.83±1.17化合物Ⅲ/%--8.26±1.3219.30±1.2740.03±1.15化合物Ⅳ/%-3.18±1.195.92±1.118.47±1.3515.79±1.40化合物Ⅴ/%15.78±1.318.65±1.1923.25±1.3128.81±1.2628.90±1.15化合物Ⅵ/%1.74±1.112.71±1.1820.19±1.1724.12±1.2226.23±1.24化合物Ⅶ/%15.21±1.5117.35±1.2721.25±1.2427.72±1.1333.10±1.18表4 各化合物对DPPH的清除率1)Table 4 The radical scavenging ratio of the compounds质量浓度/(μg·mL-1)6.2512.52550100化合物Ⅰ/%17.30±1.31∗∗23.49±3.09∗∗30.7±2.18∗37.8±1.79∗58.00±0.57∗化合物Ⅲ/%41.09±1.18∗53.64±1.14∗70.17±1.02∗81.37±1.11∗66.64±1.37∗化合物Ⅳ/%17.98±1.21∗∗18.67±1.30∗∗20.53±1.17∗∗23.97±1.35∗∗25.18±1.25∗∗化合物Ⅴ/%10.44±1.28∗∗13.35±1.15∗∗23.83±1.14∗∗44.83±1.25∗84.19±1.02∗化合物Ⅵ/%29.59±1.15∗∗36.61±1.01∗∗39.93±1.33∗∗44.72±1.04∗49.61±1.09∗化合物Ⅶ/%-0.25±1.18∗∗0.41±1.18∗∗6.95±1.05∗∗8.47±1.09∗∗Vc/%78.62±1.3990.71±1. 7692.17±1.8694.59±1.1997.39±1.26注:1) n=5,x±s；与Vc对照组比较，*为P<0.05,**为P<0.01.3 结论本研究分离出7个化合物，其中熊果酸(Ⅰ)，阿洛糖(Ⅱ)，环(异亮-缬)二肽(Ⅳ)，7-乙酰氧基-5甲氧基-6-甲酰基-2-乙基香豆素(Ⅵ)是首次从该菌种中分离得到.在抗肿瘤，胰蛋白酶活性的实验中均能表现出一定的抑制作用.其中Phenol A(Ⅲ)为桔霉素的分解产物，并且该化合物具有较好的生物活性，对于研究桔霉素的分解途径和构效关系提供了一定的基础.7-乙酰氧基-5-甲氧基-6-醛基-2-乙基香豆素(Ⅵ)作为首次从自然界分离得到的香豆素未表现出较好的生物活性，其他活性还有待考察.熊果酸(Ⅰ)作为存在于植物的三萜类化合物，具有抗肿瘤[16]，抗氧化[17]等活性，本实验从海洋真菌桔青霉Penicillium citrinum MNP12010101分离得到熊果酸为人们获得熊果酸提供了另一条途径.根据活性导向技术分离得到的所有单体化合物均有一定的活性，因此，该技术可以作为筛选海洋真菌代谢产物的有效手段，为海洋活性天然产物的分离研究提供了筛选模型.参考文献：[1] 赵成英，朱统汉，朱伟明．2010—2013之海洋微生物新天然产物[J]．有机化学，2013，33(4)：1195-1234．[2] NEWTON G G, ABRAHAM E P.Isolation of cephalosporin C, a penicillin-like antibiotic containing D-alpha-aminoa-dipic acid [J].Nature，1956，62(4)：651-658．[3] 史清文，李力更，王于方．海洋天然产物研究与新药开发[J]．药物评价研究，2010，33(3)：165-174．[4] 陈霞．海洋微生物ENP702#活性分子定点识别及分离研究[D]．杭州：浙江工业大学，2012．[5] 尹忠平，上官新晨，陈继光，等．青钱柳悬浮培养细胞三萜酸的分离及结构鉴定[J]．林业科学，2013，49(9)：23-28．[6] 张卫红．D-阿洛糖及衍生物的合成与应用研究[D]．天津：天津大学，2014．[7] HAN Zhuang, MEI Wen-li, ZHAO You-xing, et al.A New 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