应用+ERIC-PCR+技术分析多药耐药肺炎克雷伯菌的基因分型

・临床论著・应用ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ技术分析多药耐药肺炎克雷伯菌的基因分型

王芳　高梦　孙杰　冯洁　伦永志

ＤＯＩ：１０畅３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４唱０７８５．２０１３．０６．０４２作者单位：１１６６２２　辽宁省，大连大学生命科学与技术学院（王芳、冯洁）；大连大学医学院２００９级医学检验专业（高梦）；大连港医院检验科（孙杰）；大连大学医学院辽宁省高校生物物理学重点实验室（伦永志）通讯作者：伦永志，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｎｙｚ＠１６３．ｃｏｍ

【摘要】　目的　分析多药耐药肺炎克雷伯菌的肠杆菌科基因间重复一致序列ＰＣＲ（ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ）基因分

型，为临床诊断和防治肺炎克雷伯菌感染提供依据。方法　先利用纸片扩散法检测１８株临床分离的肺炎克雷伯菌对１７种抗菌药物的耐药性并获得耐药谱型；再利用ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ获得１８株肺炎克雷伯菌ＤＮＡ指纹图谱，通过非加权配对聚类分析（ＵＰＧＭＡ）法构建分子进化树；最后探讨肺炎克雷伯菌ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ基因型与其耐药性及耐药谱之间的关系。结果　１８株肺炎克雷伯菌对１７种抗生素呈不同程度耐药，对亚胺培南敏感性达１００％。１８株肺炎克雷伯菌对１７种抗生素呈现１２种耐药模式，并可分为９种基因型。结论　肺炎克雷伯菌耐药性及耐药谱与特定的ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ基因型之间存在较高程度的关联。【关键词】　克雷伯菌，肺炎；　ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ；　基因型；　耐药性；　耐药谱

Ａｎａｌｙｓｉｓｏｎｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆｍｕｌｔｉ唱ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｂｙＥＲＩＣ唱ＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ＷＡＮＧＦａｎｇ，ＧＡＯＭｅｎｇ，ＳＵＮＪｉｅ，ＦＥＮＧＪｉｅ，ＬＵＮＹｏｎｇ唱ｚｈｉ．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ１１６６２２，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬＵＮＹｏｎｇ唱ｚｈｉ，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｎｙｚ＠１６３．ｃｏｍ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅＥＲＩＣ唱ＰＣＲｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆｍｕｌｔｉ唱ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｉｒｓｔ，ｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏ

ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ１７ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓａｇａｉｎｓｔ１８ｓｔｒａｉｎｓｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｒｅｃｅｎｔｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｄｉｓｋｄｉｆｆｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｐｅｃｔｒｕｍｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｎｅｘｔ，１８ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｂｙｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｃｏｎｓｅｎｓｕｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ），ａｎｄｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒ唱ｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｏｆａｖｅｒａｇｅｓ（ＵＰＧＭＡ）．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＥＲＩＣ唱ＰＣＲｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｗｉｔｈｄｒｕｇ唱ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　１８ｓｔｒａｉｎｓｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｈｏｗｅｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｇｒｅｅｄｒｕｇ唱ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏ１７ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ａｎｄｉｍｉｐｅｎｅｍｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｗａｓ

１００％．１８ｓｔｒａｉｎｓｐｒｅｓｅｎｔｅｄ１２ｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｄｒｕｇ唱ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏ１７ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．１８ｓｔｒａｉｎｓｃａｎｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ９ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅｒｅｉｓａｈｉｇｈｄｅｇｒｅｅｏｆｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｄｒｕｇ唱ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄ

ｓｐｅｃｉｆｉｃＥＲＩＣ唱ＰＣＲｇｅｎｏｔｙｐｅｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；　ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ；　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ；　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；　Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｐｅｃｔｒｕｍ

肺炎克雷伯菌是医院内感染和社区获得性感染的一种重要的革兰阴性致病菌，已在全球范围内引起尿路感染、肺炎、腹腔感染［１］。近年来，随着抗生素的广

泛使用，肺炎克雷伯菌的耐药情况日益严重，尤其是多重耐药肺炎克雷伯菌、泛耐药肺炎克雷伯菌以及“超级细菌”肺炎克雷伯菌在医院内感染中的出现，使之抗感染治疗面临极大的挑战。临床上有必要对肺炎克雷伯菌进行耐药监测和同源性分析。本文对１８株肺炎克

雷伯菌临床分离株分别进行药敏试验和肠杆菌科基因间重复一致序列ＰＣＲ（ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ）ＤＮＡ指纹图谱分析，并对肺炎克雷伯菌的ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ基因型与其耐药性及耐药谱之间的关系进行了探讨。

资料与方法１．菌株来源：１８株肺炎克雷伯菌均为２０１１年９月至２０１２年３月分离自大连港医院住院患者标本（其中分离自痰液标本１７份，尿液标本１份），试验前重新鉴定。２．药敏试验：药敏试验方法采用标准纸片（杭州天和微生物试剂有限公司）扩散法（Ｋ唱Ｂ法），药敏试验结果解释标准采用美国临床实验室标准化委员会（ＮＣ唱ＣＬＳ）的判断标准。

・７４４２・中华临床医师杂志（电子版）２０１３年３月第７卷第６期　ＣｈｉｎＪＣｌｉｎｉｃｉａｎｓ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｒｃｈ１５，２０１３，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．６３．质粒检测：使用柱式质粒ＤＮＡｏｕｔ试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司），按照说明书进行质粒提取，以ｐＵＣ１９质粒为阳性对照，１％琼脂糖凝胶电泳分析。对无质粒菌株进行后续基因组提取操作。４．提取细菌基因组：使用细菌基因组提取试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司），按照说明书提取细菌基因组。１％琼脂糖凝胶电泳进行检测。５．ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ：引物序列按文献［２］设计：ＥＲＩＣ１Ｒ５′唱ＡＴＧＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣ唱３′；ＥＲＩＣ２５′唱ＡＡＧ唱ＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧ唱３′，由宝生物工程（大连）有限公司合成。ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ反应体系［３］：细菌基因组１μｌ，ＥＲＩＣ１Ｒ０畅５μｌ，ＥＲＩＣ２０畅５μｌ，ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１２畅５μｌ，加ｄｄＨ２Ｏ至２５μｌ。ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ反应条件：９５℃预变性７ｍｉｎ；然后９４℃变性６０ｓ，５２℃退火６０ｓ，６５℃延伸８ｍｉｎ，共３５个循环；最后６５℃延伸１６ｍｉｎ。ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ产物进行２％琼脂糖凝胶电泳检测。６．ＤＮＡ指纹图谱的聚类分析：先使用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ４畅６２软件对ＤＮＡ指纹图谱结果进行条带识别，再使用ＮＴＳＹＳｐｃ２畅１软件得到Ｊａｃｃａｒｄ的遗传相似性系数矩阵和遗传距离矩阵，采用非加权配对法（ＵＰＧＭＡ法）进行遗传分析。以相似度＞０畅７５为同一基因型，＜０畅７５为不同基因型［３］。结 果１．药敏试验结果：试验结果表明，１８株肺炎克雷伯菌菌株对哌拉西林／他唑巴坦（ＴＺＰ）、氨苄西林／舒巴坦（ＳＡＭ）、头孢哌酮／舒巴坦（ＳＣＦ）、头孢噻吩（ＫＦ）、头孢呋辛（ＣＸＭ）、头孢噻肟（ＣＴＸ）、头孢哌酮（ＣＦＰ）、头孢他啶（ＣＡＺ）、头孢吡肟（ＦＥＰ）、亚胺培南（ＩＰＭ）、环丙沙星（ＣＩＰ）、左氧氟沙星（ＬＥＶ）、阿洛西林（ＡＺＬ）、阿米卡星（ＡＫ）、磷霉素（ＦＯＳ）、复合磺胺（ＳＭＺ／ＴＭＰ）、氯霉素（Ｃ）耐药率分别为５畅６％、２７畅８％、０％、２７畅８％、３３畅３％、２２畅３％、２２畅３％、１６畅７％、１６畅７％、０％、１６畅７％、１１畅１％、９４畅４％、１１畅１％、８３畅３％、２７畅７％、３３畅３％。１８株肺炎克雷伯菌对１７种抗生素表现为１２种耐药谱型，分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ型。３、９、１０、１１、１６号菌株表现为Ⅲ型耐药谱，７、８号菌株为Ⅱ型耐药谱，１４、１５号菌株为Ⅳ型耐药谱（表１）。２．质粒检测结果：结果表明１８株肺炎克雷伯菌均未提取到质粒（图１）。３．细菌基因组提取结果：１８株肺炎克雷伯菌均成功提取得到细菌基因组（图２）。４．ＤＮＡ指纹图谱结果：试验结果表明，１８株肺炎克雷伯菌经ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ扩增，产生了９种ＤＮＡ指纹图谱并呈现出多态性（图３）。ＰＣＲ产物为１～１８条，主带为１～８条，大小介于０畅２５～７畅０ｋｂ。５．ＤＮＡ指纹图谱聚类分析：根据肺炎克雷伯菌ＤＮＡ指纹图谱结果可聚类为９个基因型（图４），分别

标记为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ基因型。其中，２、７号肺炎克雷伯菌菌株为同一基因型；４、５、６、９、１０、１１号肺炎克雷伯菌菌株为同一基因型；８、１８号肺炎克雷伯菌菌株为同一基因型；１２、１３、１４号肺炎克雷伯菌菌株为同一基因型。６．ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ基因型与对抗生素耐药性之间的关系：１８株肺炎克雷伯菌ＥＲＩＣ唱ＰＣＲ基因型与对１７种抗生素耐药性之间的关系表明：Ｅ、Ｆ、Ｇ基因型分别对１４、１１、１２种抗生素耐药；Ａ基因型只对一种抗生素耐药；Ｃ、Ｈ基因型分别对两种抗生素耐药；Ｂ基因型对三种抗

生素耐药；Ｄ、Ｉ基因型分别对四种抗生素耐药（图５）。

表１　１～１８号肺炎克雷伯菌菌株耐药谱型菌株编号耐药谱型耐受药物种类１耐１种药物（Ⅰ）ＦＯＳ７、８耐１种药物（Ⅱ）ＡＺＬ３、９、１０、１１、１６耐２种药物（Ⅲ）ＡＺＬ、ＦＯＳ１４、１５耐３种药物（Ⅳ）ＣＡＺ、ＡＺＬ、ＦＯＳ２耐４种药物（Ⅴ）ＣＸＭ、ＡＺＬ、ＦＯＳ、Ｃ１７耐４种药物（Ⅵ）ＡＺＬ、ＦＯＳ、ＳＭＺ／ＴＭＰ、Ｃ６耐５种药物（Ⅶ）ＣＩＰ、ＬＥＶ、ＡＺＬ、ＦＯＳ、Ｃ１３耐７种药物（Ⅷ）ＳＡＭ、ＫＦ、ＣＸＭ、ＡＺＬ、ＦＯＳ、ＳＭＺ／ＴＭＰ、Ｃ５耐７种药物（Ⅸ）ＳＡＭ、ＫＦ、ＣＸＭ、ＣＴＸ、ＣＦＰ、ＦＥＰ、ＡＺＬ１８耐１１种药物（Ⅹ）ＳＡＭ、ＫＦ、ＣＸＭ、ＣＴＸ、ＣＦＰ、ＣＩＰ、ＬＥＶ、ＡＺＬ、ＡＫ、ＦＯＳ、ＳＭＺ／ＴＭＰ４耐１２种药物（Ⅺ）ＳＡＭ、ＫＦ、ＣＸＭ、ＣＴＸ、ＣＦＰ、ＣＡＺ、ＦＥＰ、ＡＺＬ、ＡＫ、ＦＯＳ、ＳＭＺ／ＴＭＰ、Ｃ１２耐１２种药物（Ⅻ）ＴＺＰ、ＳＡＭ、ＫＦ、ＣＸＭ、ＣＴＸ、ＣＦＰ、ＣＡＺ、ＦＥＰ、ＡＺＬ、ＦＯＳ、ＳＭＺ／ＴＭＰ、Ｃ