重组质粒酶切鉴定及PCR实验

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验 一．实验目的 1．检验重组质粒的插入片段的大小 2．学习PCR技术的使用

二．实验原理 （一）重组质粒酶切鉴定 将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。

（二）PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。

1.聚合酶链式反应原理 PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。 PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。

2． PCR的反应动力学 PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

3． PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即长产物片段）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

三．实验材料及仪器 1．实验材料：PRC 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪 ，模板pUC19重组质粒（插入片段125bp和564bp），寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20℃贮存），dNTPs（TaKaRa，-20℃贮存），10×PCR反应缓冲液（TaKaRa，-20℃贮存）

高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)， DNA相对分子质量标准物DNA Marker k／HindⅢ，DL5000

四．实验步骤 （一）重组质粒的酶切、电泳检测

1．对于电泳显示插入片段在2.0kb以上的重组质粒，采用HindⅢ酶切进行验证。 大片段或高产量的重组质粒推荐的反应体系（10μl体系）如下： 成分 体积（μl） dd H2O 6.2 10×Buffer（含Mg2+） 1.0 Re-Puc19 2.0 HindⅢ（15U/μl） 0.8 共计 10.0

若插入片段比较小，则选用20μl体系： 成分 体积（μl） dd H2O 9.0-11.0 10×Buffer（含Mg2+） 2.0 Re-Puc19 6.0-8.0 HindⅢ（15U/μl） 1.0 共计 20.0

轻弹混匀后，短暂离心，于37℃ 孵育2hr后，保存于 -20℃，备电泳检测。 2. 酶切产物电泳检测 取酶切产物10 ul，加入2 ul 6×上样缓冲液，混匀后取6 ul点样。 取重组质粒10 ul，加入2 ul 6×上样缓冲液，混匀后取6 ul点样。 以λ DNA/HindIII为Marker。100V恒压电泳约40min。电泳结束EB染色10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。

（二）重组质粒的PCR验证/PCR扩增目的基因 对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，采用PCR进行验证。 引物此次重组用到的载体是pUC19，限制性内切酶为Hind Ⅲ，所以选择Hind Ⅲ酶切位点两侧一定距离的序列制作引物。 由于载体pUC19上两引物间序列的长度是150bp，所以PCR扩增产物的长度（bp）=150+插入片段的长度。

下图所示为pUC19部分序列，即引物来源： M13F(-47): EcoRⅠ cgccagggttttcccagtcacgacgttgTaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctc Hind Ⅲ M13R(-48)(互补链)

PCR引物为 引物名称 引物序列5’ 3’ 引物长度(mers) Tm(℃) M13F(-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC 24 64.7 M13R(-48) GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 24 57.9 1.反应体系的建立 PCR反应体系如下：

除了此反应体系之外，还要做三个反应体系：其他组分不变，只将编号6的组分换成共用564bp模板，pUC19质粒（作为模板对照），ddH2O（作为阴性对照）。 振荡混匀，然后短暂离心。

2. 反应程序的设定 将加好样的PCR管进行标记，放入PCR仪中，设定反应基本参数如表所示。 编号 项目 温度/℃ 时间 1 预变性 94 3min 2 变性 94 30s 3 复性 58 30s 4 延伸 72 转2，循环29次

5 终延伸 72 10min 6 保存 4

（1） 预变性：让DNA双链充分解离,然后第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模版上面这主要是为了保险起见，使模板DNA的二级结构充分打开。 （2） 变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。 （3） 复性：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。 （4） 延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及镁离子存在的条件下 ，

5＇-→3＇的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 （5） 终延伸：循环完成后 使PCR反应完全以提高扩增产量，在用普通Taq酶进行PCR

扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行

3. PCR产物检测： 1%的琼脂糖凝胶电泳：20ulPCR产物中加3.0ul 10×上样缓冲液，混合均匀，取5ul 点样。以DL2000plus为Marker。100V恒压电泳约40min。电泳结束EB染色10min，水洗后紫外灯下观察实验结果。

编号 组分 体积（ul） 1 dd H2O 14.8 2 10×Buffer（含Mg2+） 2.0 3 dNTP（2.5 mM each） 1.6 4 M13F（10μM） 0.8 5 M13R（10μM） 0.8 6 模板（约10ng/μl） 1.0 7 Taq酶（5u/μl） 0.2 总体积 20.0