实验三 质粒DNA的酶切鉴定

质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。

酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。

限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。

酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。

首先，选择适当的限制性内切酶。

限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。

在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。

选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。

其次，进行质粒酶切。

通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。

反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。

酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。

然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。

它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。

较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。

通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。

最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。

琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。

常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。

经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。

总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。

这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级： 2018级临床卓越创新班组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2019-11-05 实验地点第四实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03一、实验目的1.学习并掌握碱裂解法提取质粒的方法2.掌握紫外吸收测定DNA的操作3.了解质粒酶切鉴定原理和方法4.掌握琼脂糖凝胶电泳技术原理，操作二、实验原理1. 碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

1）pH =12.6（碱性），染色体DNA：氢键断裂，变性。

质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

（不完全变性）2）（在1）溶液加入KAc溶液调节pH），中性，质粒DNA：复性，继续溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成了、缠连的网状结构。

3）离心后，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来2. 离心层析柱1) 硅基质膜在高盐、低pH值的状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；3. 质粒DNA定量测定：紫外光分光光度计法1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2）而且物质对光的吸收是具有选择性的3）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱4）因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在紫外光260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。

5）DNA对波长260nm的紫外光有特异吸收峰，蛋白质在280nm紫外光处有特异吸收峰，A260/A280可以反应DNA纯度。

4.质粒DNA的酶切分析限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA5.琼脂糖凝胶电泳（有电荷效应，分子筛效应）不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动速率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。

质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。

实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。

限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。

实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。

2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。

3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。

4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。

实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。

每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。

实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。

通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。

如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。

2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。

如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。

如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。

3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。

酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。

如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。

实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。

这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。

一、实验目的1. 学习并掌握质粒DNA的提取方法。

2. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和操作方法。

3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定质粒DNA的酶切位点。

二、实验原理质粒DNA是细菌染色体外的DNA分子，常用于基因克隆和分子生物学研究。

限制性核酸内切酶（RE）是一种可以识别并切割特定DNA序列的酶，常用于分子生物学实验中。

本实验通过提取质粒DNA，利用限制性核酸内切酶进行酶切反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，以鉴定质粒DNA的酶切位点。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌株（含有目的质粒）、限制性核酸内切酶、琼脂糖、DNA 分子量标准、TAE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR仪等。

2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、异丙醇、70%乙醇等。

四、实验步骤1. 质粒DNA的提取（1）取适量大肠杆菌菌株，加入适量无菌水，用玻璃棒轻轻搅拌，制成菌悬液。

（2）向菌悬液中加入适量的Tris-HCl缓冲液、EDTA和蛋白酶K，充分混匀。

（3）将菌悬液放入65℃水浴中，孵育30分钟。

（4）向菌悬液中加入适量的SDS和酚/氯仿，充分混匀。

（5）12,000 r/min离心10分钟，取上清液。

（6）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置2小时。

（7）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。

（8）向沉淀中加入70%乙醇，混匀，室温静置5分钟。

（9）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。

（10）将沉淀溶于适量的无菌水中，即为质粒DNA。

2. 酶切反应（1）取适量的质粒DNA，加入适量的限制性核酸内切酶，混匀。

（2）将混合液置于37℃水浴中，孵育适当时间。

（3）酶切反应结束后，加入适量的EDTA，终止反应。

3. 琼脂糖凝胶电泳分析（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA分子量标准。

（2）将酶切反应产物加入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳。

一、实验目的1. 理解并掌握限制性核酸内切酶（RE）的原理及其在分子生物学中的应用。

2. 掌握质粒DNA的提取方法。

3. 学习并实践质粒DNA的酶切技术。

4. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用。

5. 分析酶切结果，鉴定目的基因。

二、实验原理限制性核酸内切酶（RE）是一类能够识别特定的DNA序列并在该序列处切割双链DNA的酶。

它们在分子生物学中具有广泛的应用，如基因克隆、基因编辑、基因表达调控等。

质粒DNA是常用的克隆载体，其提取方法主要有碱裂解法、盐析法等。

本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

酶切是将质粒DNA切割成大小不同的片段，通过琼脂糖凝胶电泳技术分离这些片段，从而鉴定目的基因。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分析技术，其原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率差异进行分离。

在电场作用下，DNA分子带负电荷，会向正极移动。

DNA分子的大小与其迁移速率成反比，因此，通过比较不同片段的迁移距离，可以鉴定DNA片段的大小。

三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶（RE）3. 琼脂糖凝胶4. TAE缓冲液5. DNA marker6. 电泳仪7. 显色剂8. 紫外灯四、实验步骤1. 质粒DNA提取- 将含有质粒DNA的菌液接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。

- 取适量菌液，加入等体积的碱裂解液，混匀，室温放置5分钟。

- 加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟。

- 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。

- 加入700 μL 70%乙醇，混匀，室温放置5分钟。

- 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。

- 加入50 μL无菌水，混匀，即得质粒DNA。

2. 酶切- 取10 μL质粒DNA，加入10 μL限制性核酸内切酶缓冲液，混匀。

- 加入1 μL限制性核酸内切酶，混匀。

- 37℃水浴反应3小时。

3. 琼脂糖凝胶电泳- 配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA marker。

《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验【实验目的】1、掌握实用的分子生物学基本操作技术；2、提高处理DNA样品的操作技能；3、学会使用限制性内切酶对DNA样品进行酶切；4、学会配制琼脂糖凝胶；5、学会使用电泳技术分析和鉴定DNA分子。

【实验原理】1、质粒DNA的限制性酶切DNA的酶法操作是DNA重组技术中一项最常用的工具。

特别是一系列限制性内切核酸酶的使用，能够在特异性位点切割DNA，对从分子水平上认识基因的结构与功能和进行重组DNA技术研究是非常有用的。

限制性内切酶来源于细菌，能够在特异性的目标序列中（即限制性酶切位点）切割双链DNA，从而产生特定的DNA片段（即限制性酶切片段）。

内切酶是细菌限制与修饰体系中的一员，能够使细菌细胞免受外源性DNA的侵害，即通过切割噬菌体DNA中的特异性位点来限制细菌噬菌体的繁殖，从而抑制噬菌体对细菌细胞内的入侵。

细菌通过修饰限制酶的识别位点来防止限制酶破坏其自身的DNA，通常是利用对识别位点中1个碱基的甲基化修饰来实现的。

历年来，从细菌细胞内分离纯化的限制性内切酶的种类在不断增加，并越来越多的被分子生物学家应用到DNA的体外操作中。

每种限制酶都能识别1段特异的DNA序列，其中最常见的是长度为4-6 bp的回文序列（反向重复序列）。

同时，不同种类的限制酶在识别的切割位点是不同的，有些可能是在识别位点的中间切开，产生平末端（钝末端）；而另一些限制酶可能是将识别位点错位切开，生成5’或3’突出末端（黏性末端）。

表2列举了本实验中所使用的2种限制酶的识别位点和切割位点。

表2 2种限制酶的识别位点和切割位点注：↓或↑：表示酶切位点。

2、DNA限制性内切酶酶切图谱（1）图谱简介DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。

质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析摘要限制性内切酶发现于某些大肠杆菌体内，能够“限制”噬菌体对其感染并帮助将已殖入的噬菌体序列移除，可以识别双链DNA上特异序列（限制性位点）并酶切。

限制酶极大地促进了分子生物学、基因工程与遗传工程领域的进展。

[1]本实验通过对大肠杆菌质粒DNA的酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，与未酶切的质粒DNA比较，分析酶切结果。

同时，本次电泳还鉴定了提取纯化的大肠杆菌基因组DNA的纯度，以及大肠杆菌HSP70基因的PCR产物。

关键词限制性内切酶；琼脂糖凝胶电泳引言自从从嗜血杆菌(Haemophilus influenza)中分离到第一种限制性内切酶---HindⅢ,[2]人们开始意识到限制性内切酶的巨大应用前景。

Daniel Nathans,Werner Arber和Hamilton O. Smith在1978年即因限制性内切酶的发现和在分子遗传学的应用被授予诺贝尔生理与医学奖。

人们将限制性内切酶应用到DNA重组技术中，在用基因重组型大肠杆菌大规模生产人胰岛素获得巨大的成功。

现在限制性酶切与PCR一样成为分子生物学中最常用的实验手段之一。

限制性内切酶被分成四种：Types I,II,III和IV。

Types I酶切位点距离识别位点较远，是具有限制性内切和甲基化修饰的多功能酶，作用时需要ATP和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine），如EcoB,EcoK。

Types II酶切位点位于识别位点之中会较近距离，只具有限制性内切的单功能酶，作用时需要Mg2+，如EcoRI,HindIII。

Types III酶切位点距离识别位点较近，具有限制性内切活性，也被发现是修饰性甲基化酶复合物的一部分。

作用时需要ATP（但不水解ATP）和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine）刺激反应，如EcoPI, HinfIII。

质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法二、实验原理:外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术,这样重新组合的DNA分子叫做重组子;重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经限制性内切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和外源DNA分子连接连接连接连接起来;将重组质粒导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中,将转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养,可以通过αααα互补筛选法互补筛选法互补筛选法互补筛选法筛选出重组子,并可通过酶切酶切酶切酶切电泳电泳电泳电泳及PCRPCRPCRPCR检验检验检验检验的方法进行重组子的鉴定;1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱,选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点,否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA 时不能得到完整的目的基因;其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子;常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种;本实验采用单酶切法,即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段,酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端,再选用同样的限制性内切酶处理载体;在构建重组子时,除了形成正常的重组子外,还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中,或目的DNA串联后再插入载体分子中,甚至出现载体分子自连,重新环化的现象;单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂;各种限制性内切酶都有去最佳反应条件,最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成,在双酶切体系中,限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐,先低温后高温”的原则进行反应;要达到高效率的连接,必须酶切完全,酶切的DNA数量要适当;另外,酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量,以及相应的所需酶的量;可以适当增加酶的用量,但是最高不能超过反应总体积的10%,因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中,如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%,就会抑制酶的活性;连接反应总是紧跟酶切反应,外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的;DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键;在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4DNA连接酶,它可以连接黏性末端和平末端;连接反应时,载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:1~3之间,可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象;反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间,一般是16℃,用常用的连接时间为12-16h;2.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化;能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞,即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态,它决定于受体菌的遗传特性,同时与菌龄、外界环境等因素有关;人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力,或人为地将DNA导入细胞内,该过程与细菌自身的遗传控制无关,常用热击法,电穿孔法等;能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关,所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株;目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法,制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油,-70℃可保存半年至一年;经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加,允许外源DNA分子进入;在低温下,将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合,经过热击或电穿孔技术,使载体分子进入细胞;进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达,使受体细胞出现新的遗传性状;将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养,即可筛选出重组子;本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞,用CaCl2处理,使其处于感受态,然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s,实现转化;3.重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后,并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子,一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞,同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖;并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起;再者,在这些被转化的受体细胞中,除部分含有我们所期待的重组DNA分子外,另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致;因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子,并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子;本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法;抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选,而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活,α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子;质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因Ampr,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子;没有导入质粒PUC19的受体细胞,在含有氨苄青霉素的平板上不生长;质粒PUC19进入E.coliDH5α后,通过α-互补作用,形成完整的β-半乳糖苷酶;在麦康凯培养基平板上,转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸,pH降低,培养集中的指示剂变红,转化子的菌落变红;不含质粒的E.coliDH5α,没有β-半乳糖苷酶活性,不能利用培养集中的乳糖产生有机酸,而是利用培养集中的有机碳源,不使培养基pH降低,在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落;重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部,不能形成α-互补作用,所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸,在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落;挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落,通过扩增培养;因为许多菌落存在假阳性情况,在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA 菌落,也可能是载体自连后发生突变的菌落,所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小,可将重组的载体DNA提取出来,进行后续的酶切、电泳检验;也以提取的重组质粒为模板,利用现有的引物,进行那个PCR扩增,检测个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒;4.PCR技术PCRPolymerasechainreaction即聚合酶链式反应,其原理类似于DNA的体内复制,又叫做“体外基因扩增”;反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+,4种脱氧核糖核酸dNTP、DNA聚合酶和合适的缓冲体系;反应基本程序包括DNA变性、引物复性及引物延伸三个基本过程;这三个反应构成一个循环,反复进行;每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板;理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍,反复30次,特异DNA序列片段以指数方式可扩增105~106;通过此技术可以使非常微量的DNA产生大量的PCR产物,因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术;现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的TaqDNA聚合酶,而且大大提高了扩增片段的特异性、灵敏性和扩增效率;反应中用的引物有两段,一条称为上游引物或者正向引物,一条称为下游引物或者反向引物;引物的设计十分重要,在设计时应遵循以下原则：长度一般为18到24个碱基；G+C的百分含量在40%~60%；单条引物内部避免含有二级结构,避免形成引物二聚体；最好以1到2个G或C碱基开始或结束；引物的5’端可以被修饰,但是3’端绝对不能进行任何修饰,而且引物的3’端要避开密码子的第三位;模板的浓度不能太大,dNTP的浓度为2.5mmol/L,金属离子的浓度为1.5mmol/L,缓冲液为pH为7.2~8.0的Tris —HCl溶液;二、实验材料：1.菌株：E.coliDH5α2.培养基：LB培养基、麦康凯培养基加入氨苄青霉素3.试剂材料：酶切反应：DNAPUC19质粒,酶切10×buffer,HindⅢ,重蒸水,λDNA;连接反应：酶切后的DNAPUC19质粒和λDNA,连接10×buffer,T4连接酶,重蒸水;感受态细胞的制备：0.1MCaCl2转化：连接液和感受态细胞,0.1MCaCl2,冰块;重组菌的挑选、检验：试剂盒含有RnaseA的溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer,酶切后的DNAPUC19质粒,试剂盒抽提的DNA,酶切10×buffer,HindⅢ,重蒸水,琼脂糖,TAE缓冲液;上样缓冲液,EB染液;PCR检测：10×PCRbuffer,dNTP,模板,引物1,引物2,水,TaqDNA聚合酶,琼脂糖,TAE、溴化乙锭EB4.仪器器材：20、200、1000ul的枪和枪尖,1.5ml的Ep管,恒温培养箱,水浴锅,平板,三角瓶,试管,接种环,牙签,酒精灯,火柴,冰箱,离心机,电泳槽,紫外仪,PCR扩增仪三、实验步骤载体与外源片段的酶切→连接→感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与电泳检测→PCR检测一酶切1、在两支Eppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分,混匀,适当离心,使样品集中于管底；酶切反应各成分添加如下：2、在37℃恒温水浴锅中反应1h以上;3.分别取上述酶切样品2~5uL,与1~2uL电泳上样缓冲液混合均匀,进行琼脂糖凝胶电泳,观察酶切反应是否彻底,剩余样品可以继续酶切;4.待电泳观察酶切反应完全后,将剩余样品从恒温水浴锅中取出,置65℃恒温水浴锅中保存10~15min,终止酶切反应5.样品可以直接进行酶切反应或者保存于-20℃冰箱备用二连接1、在Eppendorf管中依次加入连接反应的各种成分,混匀,适当离心,使样品集中于管底；连接反应各成分添加如下：3、连接产物可用于转化实验;三感受态细胞的制备1、用接种环从含有E.coliDH5α的培养基平板上挑取少量灰白色E.coli菌落接种到20mlLB培养基里,37℃振荡培养过夜;实验均在无菌条件下,以防污染；2、取37℃过夜培养物,此时的培养物较浑浊,颜色变深;按1%的接种量吸取200μl转接到20mlLB培养基中,37℃振荡培养2.5~3小时；3.分别取1.5ml菌液于2个无菌的1.5mlEppendorf管中,5000rpm离心5min,弃上清液,吸干；重复收集菌体一次,使菌量增多；每支离心管中加入用冰预冷的1ml0.1mol/lCaCl,漩涡震荡使细胞悬浮混匀,冰上放置15min,4℃5000rpm离心5min；4、弃上清液,吸干后,加入100ulCaCl悬浮冰浴至使用；上述方法制好的感受态细胞置于冰上,48h之内均可用于转化,分装成2x50ul和100ul三管;四转化实验1、取制备好并摇匀后的3管感受态细胞悬液,分别作如下处理：1感受态细胞悬液50uL+pUC19质粒DNA1uL2感受态细胞悬液50uL+DH5a3感受态细胞悬液100uL+连接产物5uL2、将以上各样品管轻轻摇匀,冰浴10min,在42℃水浴中热击90s,然后迅速置于冰上2~3min,质粒已经吸附到感受态细胞的表面,此时不能剧烈振荡,以增加转化效率；3、向上述3管中分别加入450ul、450ul和900ul新鲜的LB培养基混匀后,37℃摇床培养1~2h,使受体菌恢复正常生长状态;五稀释和涂布平板1、无菌操作,将转化细胞溶液按以下操作涂布平板：⑴受体菌对照管：取50ul受体菌液分别涂布含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基；⑵pUC19质粒对照组：取50ul培养液涂布于含有氨苄青霉素的麦康凯培养基；⑶重组质粒转化组：取50ul、100ul、150ul、200ul培养液分别涂布含有氨苄青霉素的麦康凯培养基2、当菌液完全被培养基吸收后大约10min倒置培养皿,于37℃恒温培养24~36h,观察菌落生长情况红白菌落法;六重组子的筛选与鉴定1、取一个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板,在底部划线分成6个区域；在涂有重组质粒转化组的平板上分别选取6个单个的白色转化子,用接种针划线转接到平分成6份的含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上；37℃过夜培养；2、在划线的6个单菌落中选取4个,分别接种到含有5ml带氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜；七试剂盒抽提重组质粒DNA及鉴定1、分别取3ml菌液,用Omega试剂盒抽提重组质粒DNA,具体步骤见说明书；2.将pUC19质粒酶切及两组重组质粒酶切体系加入10loadingbuffer,混合均匀,进行琼脂糖凝胶电泳,电泳1h左右;1~2uL样品+1~2uLLB+1~2uL水注意事项1.本实验属于微量操作,用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中;2.实验中所用塑料器材都必须是新的,并且经过高温灭菌,操作时打开使用,操作过程中要注意环境干净,戴手套操作,尽量减少走动,缩短Ep管开盖的时间;3.不论是酶切还是连接反应,加样的顺序应该是,先加双蒸水,其次是缓冲液和DNA,最后加酶;且前几步要把样品加到管底的侧壁上,加完后用力将其甩到管底,而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出,酶管放置冰上,取酶液时吸头应从表面吸取,防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液;取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下,并充分混匀;4.Ep管的盖子应盖紧,防止水浴过程中水汽进入管内,并做好标记以防样品混淆;5.转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染,整个操作过程应在无菌条件下进行;6.电泳时使用的缓冲液最好是现配现用,以免影响电泳效果;7.制备凝胶时,应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长,否则溶液将会暴沸蒸发,影响琼脂糖浓度;制胶时要除去气泡;拔梳子时要特别小心,以防凝胶与支持物脱离;8.上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿;也不要快速挤出吸头内的样品,避免挤出的空气将样品冲出样品孔;9.溴化乙锭是一种强烈的诱变剂,有毒性,使用含有这种染料的溶液时,应带上乳胶手套进行操作;勿将溶液滴洒在台面上,实验结束后用水彻底冲洗干净;10.紫外线对眼睛和皮肤均有伤害,对眼睛尤甚;观察电泳条带时要确保紫外光源得到适当遮蔽,并应戴好目镜或眼罩,避免皮肤直接暴露在紫外线下;11.实验中加样后应及时更换吸头,以避免试剂的污染;12.PCR反应高度灵敏,应设法避免污染,如戴一次性手套操作,使用一次性PCR管和吸头,反应加样区应与DNA模板制备区及PCR产物电泳检测区分开;13.PCR管单加样时,对于非常微量的样品一定将样品加在管壁上或者液体中,防止漏样;14.实际操作时,为了防止少加样,可以保存每次用过的枪尖,通过数枪尖知道自己加到哪一步了;五、结果与分析1、pUC19质粒DNA酶切结果目的基因与pUC19质粒载体酶切以后经过琼脂糖凝胶电泳,紫外成像如下：从左到右各泳道分别为：第1泳道：λDNA/HindIII；第2、3泳道：λDNA及λDNA/HindIII；第4、5泳道：pUC19质粒及pUC19/HindIII；第6-15泳道：第1-10组的pUC19/HindIII样品；第16泳道：pUC19/HindIII；第17泳道：λDNA/HindIII；我所在组为第9组,为第14泳道所电泳样品;对比酶切时的Marker和商业酶切质粒,可知带①为线性pUC19质粒,带②基本上为未切开的双螺旋pUC19质粒;对比带①与带②可以发现,带①的亮度和宽度仅为带②的一半左右,所以说明有三分之二的双螺旋质粒没有被切开,具体原因可能为：酶切时间短；酶活性较低；酶切反应的buffer不合适等;2、转化结果质粒转化进入感受态细胞后,在培养基上进行涂布并过夜培养,第二天观察培养基培养情况;表4平板内菌落的正确生长状况但是我们组的平板内全部有很多菌落生长,可能原因有：1.操作不当,涂布时有其他液体混入2.氨苄失活3、重组质粒的筛选与鉴定1重组质粒进行酶切以后,进行琼脂糖凝胶电泳,得成像如下图本组使用的重组质粒来自其他组从左至右各泳道分别为：第1泳道：λDNA/HindIII；第2泳道：pUC19质粒；第3-22：第1-10组的重组质粒R,R；我所在组为第9组,重组质粒为第19、20泳道;通过对比可以看出两个重组质粒连接的应该都是125bp的小片段六、实验小结1、总结与反思⑴溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套;⑵酶切反应的所有塑料制品Eppendorf管、吸头等必须是新的,并经过高温灭菌,操作时打开使用,操作过程不要求无菌,但要注意手和空气中杂酶的污染,因此要求环境干净,戴手套操作,尽量减少走动,缩短Eppendorf管的开盖时间；⑶感受态细胞必须从纯菌种开始;从划线纯化的单菌落开始,进行活化培养,不要使用多次转接或储存在4℃的培养菌液,其目的是为了保持菌株的纯度和活力；⑷培养时间：过夜培养是一个普遍接受的概念,而且适合大部分情况;如果出现了问题,调整培养时间会有帮助：染色体断裂多,则增加培养时间；酶切出现问题,则减少培养时间；⑸菌体的彻底悬浮：如果没有彻底悬浮菌体,则残留的菌体团块在SolutionII加入后,变成一个外围几乎彻底裂解,往里不完全裂解,中间没有裂解的团块;这个团块在SolutionIII加入后,会有一部分蛋白质继续存在于溶液中,成为蛋白质残留的最大根源；⑹使用相对过量的试剂：这是适合所有核酸抽提的建议;试剂相对过量的好处是：稳定性好,纯度高,操作更简单;如果认为这样不经济,就少用一点菌体；⑺配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶,琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓；⑻限制性内切酶的酶切反应属于微量操作技术,无论是DNA样品还是酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系；2、思考题1从电泳图上如何判断质粒DNA是否单酶切完全答：没有酶切的质粒处于超螺旋状态,因此在电泳图上原则上只能看到超螺旋条带;单酶切后质粒处于线状,如果单酶切不完全可能出现超螺旋状态和线状质粒条带同时存在,可以添加原质粒未酶切样品及同种质粒酶切完全样品做Maker,通过对比单酶切后的质粒条带是否单一及是否为线性进行判断;2影响质粒DNA转化效率的因素有哪些答：准备用来制备感受的细菌的生长状态与密度,制备感受态时细菌应处于对数期或者对数前期；质粒DNA的数量、大小与构型,质粒DNA数量不应太多,而分子量越大的质粒转化效率越低,超螺旋质粒DNA的转化效率高于重组DNA,环状DNA转化效率高于线性DNA；进行转化所用的试剂的纯度、质量和器材的洁净程度；数否杂菌及外源DNA污染;。