质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定(2011-04-29 10:42:22)转载▼质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。
质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。
T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。
当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。
（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
