质粒dna的提取和鉴定
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质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术,但提取方法有很多种,以下介绍一种最常用的方法:碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下:1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH,1%SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
7、以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇,混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10,000rpm离心20min,弃上清。
10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。
质粒DNA是一种圆形的DNA分子,广泛存在于细菌和真核生物中。
提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。
本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤,以供初学者了解和学习。
实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一:培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物,将其接种至含有适当抗生素的培养基中。
2.在37℃恒温摇床上培养过夜,确保细菌得到充分生长。
步骤二:收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟,以沉淀细菌细胞。
2.弃去上清液,将细菌细胞沉淀保留在离心管中。
步骤三:质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒,按照说明书中的步骤操作。
不同试剂盒所用方法有所差异,详细操作请参照试剂盒说明书。
2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞,充分混合。
3.通过离心将细菌细胞裂解,释放出质粒DNA。
不同试剂盒所用离心条件有所不同,一般为高速离心1-3分钟。
4.弃去上清液,留下含有裂解细胞的混悬液。
步骤四:质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。
2.加入适量的洗涤缓冲液,充分混合。
3.通过离心将质粒DNA沉淀,弃去上清液。
4.加入适量的洗涤缓冲液,充分混合。
5.通过离心将质粒DNA沉淀,弃去上清液。
6.加入适量的洗涤缓冲液,充分混合。
7.通过离心将质粒DNA沉淀,弃去上清液。
8.加入适量的洗涤缓冲液,充分混合。
9.通过离心将质粒DNA沉淀,弃去上清液。
10.加入适量的洗涤缓冲液,充分混合。
11.通过离心将质粒DNA沉淀,弃去上清液。
12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA,使其浓度适宜。
步骤五:质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。
2.准备一份对照组,即只含有去离子水的样品。
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理:碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于~这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素(Amp:50μg/mL)的LB液体培养基加入到试管中,接入含pUC19质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中,4000r/min离心2min。
3、吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中,充分混匀,室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ(新鲜配制),盖紧管皿,混匀内容物,将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min,离心15min,将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚:氯仿(1:1)(去蛋白),反复混匀,12000r/min,离心5min,将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置5~10min。
12000r/min,离心5min。
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中,大多是双联的共价闭合环状DNA分子,长度可以从1kb 到200kb不等,是染色体外寄生性的自主复制子,在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中,为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA,通常使用松弛型(其复制受宿主的控制不严格,在宿主细胞中拷贝数较多)质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多,常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下,染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性;质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离,当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时,变形的质粒DNA又恢复到原来的构型,通过离心保留在溶液中,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的网状结构,与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中,由于各种因素的影响,同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型:①超螺旋型,即共价闭合环状DNA(cccDNA);②一条链发生一处或多处断裂,致使另一条链发生自由旋转,分子内的扭曲折叠消失,形成松弛的分子即开环DNA(ocDNA);③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中,cccDNA由于扭曲折叠,体积很小,在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小,迁移速度最快;ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状,迁移速度较慢;线状DNA受到的阻力最大,迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,除受分子构型的影响,还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时,应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应,分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异,由此将不同构型的质粒DNA 分开。
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名:肖风学号:2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用,掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法,即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理,凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中,碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单,易于操作,一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白,可通过酚/氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒DNA的提取与鉴定实验日期 2020.5.14 室温 25℃成绩实验报告摘要实验目的:①掌握质粒提取原理和各种试剂的使用②掌握琼脂糖凝胶电泳原理和方法实验方法:琼脂糖凝胶电泳法实验结果:质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图获得三条带,从近到远分别为开环状DNA;线状DNA;超螺旋状DNA实验结论:碱性裂解法可以从大肠埃希菌中提取到质粒DNA实验原理1、质粒是独立存在于染色体,能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA,分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。
2、细菌质粒是应用最多的质粒群体,在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA。
3、对数期菌体:具有质粒的大肠埃希菌。
4、溶液 I 充分重悬:50 mmol/L 葡萄糖:使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
25 mmol/L Tris-HC1(pH 8.0) :维持PH。
10 mmol/L EDTA(pH 8.0):二价金属离子的螯合剂、消除游离Mg2+等二价金属离子,抑制DNA酶的活性。
5、溶液II裂解:0.2 mol/L NaOH:主要作用溶解细胞,释放DNA;l% SDS:阴离子去垢剂。
作用:既能裂解细菌细胞膜,又能使细菌蛋白质变性。
质粒DNA具有特定的形态结构,在特殊环境下,如加热、极端PH等,能变性。
SDS处理细菌细胞能导致细菌细胞壁破裂,释放质粒DNA和细菌基因组DNA。
6、溶液III中和:5 mol/L 醋酸钾:使钾离子置换SDS中的钠离子,形成PDS(十二烷基硫酸钾)。
因为SDS遇到钾离子后变成PDS,而PDS是不溶于水,同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。
冰乙酸:中和NaOH。
去除变性条件后,质粒DNA能复性,在加入强碱NaOH后,通过酸性的醋酸钾中和碱性溶液,质粒DNA便能迅速复性。
需要注意,染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性,所以,离心后,能将质粒DNA留在上清中,染色体DNA则和细胞碎片一起沉淀在离心管底部。
质粒DNA的提取与鉴定实验报告1. 实验目的本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA,掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
2. 实验原理质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。
常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。
本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。
步骤如下: 1. 培养目标细菌,并收集细菌培养物。
2. 细菌培养物离心,收集细菌沉淀。
3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。
4. 加入溶解剂,使细胞溶解。
5. 加入酒精,沉淀出质粒DNA。
6. 分离质粒DNA,去除其他杂质。
7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。
3. 实验步骤3.1 培养目标细菌1.取出目标细菌的冻存管,从-80°C的冷冻库中快速解冻。
2.取出琼脂平板,用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上,利用无菌鹤嘴锄均匀涂抹。
3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中,培养一夜。
3.2 收集细菌培养物1.取出含有细菌的琼脂平板,加入适量的无菌LB培养基。
2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。
3.将离心管放入低速离心机中,离心5分钟,将细菌沉淀收集。
3.3 细胞裂解1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。
2.充分混合后,放置在冰上浸泡20分钟,使细菌细胞膜裂解。
3.4 细胞溶解1.加入等体积的溶解剂,充分混合。
2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。
3.5 DNA沉淀1.向离心管中加入等体积的冷酒精。
2.轻轻倾斜离心管,使酒精与溶液充分混合。
3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。
3.6 分离质粒DNA1.将离心管放入高速离心机中,离心10分钟。
2.将上清液倒出,保留下沉淀。
3.7 测定质粒DNA的纯度和完整性1.使用纳米比色计测定质粒DNA的浓度和纯度。
2.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。
4. 结果与讨论根据实验结果,我们成功提取到了质粒DNA,并验证了其纯度和完整性。