第六章 分子克隆常用的载体

中转录为2个mRNA分子 翻译成病毒蛋白 包装成病
毒粒子 释放到细胞外
结构:
i. 长末端重复(long terminal repeat, LTR) ii. 正链和反链引物序列PB(-), PB(+) iii. 包装序列Ψ(gag基因编码区5’-端420 bp序列) iv. 反式作用基因: gag—核心蛋白; pol—反转录酶/整合酶;
物，短暂表达。
2. RNA病毒载体
BMV（雀麦花叶病毒）和TMV载体优点： 1）转化频率高; 2）宿主范围广; 3）高拷贝，外源基因高效表达。
第七节
动物分子克隆载体
一. 构建动物克隆载体的病毒种类和特征
病毒类型 例子 病毒大小(nm) 基因组结构
细小病毒
野生型 H-1,RV,MVM 20
ss-DNA
该系统的最终转化频率比SEV系统高得多
3）标记基因
生化标记基因：冠瘿碱合成酶基因（NOS，OCS）lacZ, CAT, 荧光酶基因，GUS
药物抗性标记基因：除草剂耐受性基因，CHMTⅡ（金 属巯蛋白基因），Bleomycin，Hgyr，SPT, DHFR, NPTⅡ
(Kanr, G418r) 标记基因常用的启动子有CaMV 35S,OCS,NOS等。
第六节
植物克隆载体
一、Ti质粒载体
1. 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与Ti 质粒
G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿 瘤(crown gall tumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征： i. 不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.合成肿瘤特有的化合物—冠瘿碱(opine)，能专一 的为根癌农杆菌所利用. 这两个特征由Ti质粒决定， 但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。

代完全相同的子代群体。
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第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
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第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
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第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
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第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
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第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链

.克隆载体及其主要功能载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。

质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。

目前，能在不同受体细胞中使用的载体有数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。

质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为4.3kb。

pBR322带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。

通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。

因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。

另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的染色体并不复制。

在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。

和质粒不同的是，噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。

通常，作为克隆载体的噬菌体，都经过一定的突变和缺失处理。

因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后，并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。

和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。

3.重组克隆筛选3.1.抗性基因插入失活筛选法根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。

如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。

带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。

但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。

第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。

教材内容精要一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。

1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。

2．转化与转导作用(1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。

(2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。

可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。

4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。

基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。

二、重组DNA技术’1．重组DNA技术的相关概念(1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。

DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。