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分子克隆常用载体PPT课件

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大肠杆菌分子克隆载体 PPT课件

大肠杆菌分子克隆载体 PPT课件
第三节
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
6) λ载体的种类
i. 插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如 λgt11，可以插入长达7 Kb的DNA。这类载体被限制酶 切成左右臂。 ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段 DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体 常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源 基因 （LacZα启动子）。
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
ori
三. 噬菌体载体
二、质粒与质粒载体
1. E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接 合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）
2.质粒的特点
1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料， EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中

植物生物技术研931-分子克隆PPT课件

植物生物技术研931-分子克隆PPT课件

质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
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Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
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质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质

第三章 分子克隆的载体 ppt课件

第三章 分子克隆的载体 ppt课件
✓ 选择标记基因selective marker gene 用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的
宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记
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•氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） •四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） •氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） •卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
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2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片 段插入到载体中。
34
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二、质粒载体的种类
1. pBR322之前 2. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标
的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天
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•正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因 产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。 如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来 说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组 子。

基因克隆简介ppt课件

基因克隆简介ppt课件

5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
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（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
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PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
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⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
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2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。

基因克隆的载体 PPT课件

基因克隆的载体 PPT课件
基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。

分子克隆ppt课件

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重组DNA的筛选与鉴定
重组DNA的筛选与鉴定方法
1 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 2 限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
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• 平板筛选
是指利用载体的遗传性标记在平板上直接 筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化 宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet） 的培养平板上生长；未转化的则不能生长
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长 度仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
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8
λ噬菌体结构
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上 有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把 噬菌体的DNA注入细菌内
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cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半 乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落
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LOGO
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3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
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从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
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分子克隆载体的选择-PPT课件

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5. 合适的克隆位点
单克隆位点和多克隆位点
第九节
分子克隆载体的组建
构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点， 标记基因，载体容量等。
1. 克隆位点的建立
1) 体外重组
i. 减少限制酶识别位点 ii. 增加限制酶识别位点： 人工接头，匹配接头
2) 体内重组或突变
i. 减少限制酶识别位点 体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系 列载体时，去除Kanr 基因中的indIII位点就采用了以下技 术路线： 培养有pNG35的大肠杆菌细胞 提取质粒DNA 用HindIII 完全酶切 转化大肠杆菌 再提取质粒DNA 再酶切，
2. 标记基因的建立
1）启动子 2）编码区—密码子偏爱性，基因产物适用范围 3）终止子
3. 载体容量
尽可能除去无关的DNA序列。
第二章 练习题
1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位 点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设? 2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落， 兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳 检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质 粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白 色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可 设计何种实验证明你的解释是正确的? 3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化 E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类， 即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样， 从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收 插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却

《分子克隆实验设计》PPT课件

《分子克隆实验设计》PPT课件
二、特点： 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
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测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
5
质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
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质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
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转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
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酶切电泳筛选(*)

克隆载体表达载体(课件)PPT课件

克隆载体表达载体(课件)PPT课件
详细描述
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。

基因克隆载体PPT幻灯片

基因克隆载体PPT幻灯片
二、基因克隆载体
（一）载体的功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体
（一）载体的功能及特征
载体(vector)：
在基因工程操作中，能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA分子。
载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
2、不相容性(incompatibility)
指任何两种含相似复制子结构的不同 质粒，不能同时存在于一个细胞中。
分子机制：
两种含不同复制子结构的不同质粒，在 复制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使 两种质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周 期和细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞 内。
两种含相似复制子结构的不同质粒，在 复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使 两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多 的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
1）接合型质粒：
除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另 一个细胞，如F质粒。
2）非接合型质粒：
虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
不能在天然条件下独立地发生接合作用， 如ColE1质粒。
2）存在于细菌、真菌、 蓝藻、酵母等细胞中。
plasmid DNA
Genomic DNA
The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell

《分子克隆》PPT课件

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聚丙烯酰胺凝胶电泳法筛选第六节重组dna分子的操作过程118限制性内切酶dna连接酶基因载体目的基因染体外包装带重组体的宿主细胞表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达119农业应用获得高产稳产和具有优良品质的农作物向日葵培育具有抗逆性的作物新品种抗虫抗病毒抗除草剂抗盐碱抗高温抗干旱第七节基因工程的应用培育体形巨大品质优良的动物超级小鼠超级绵羊超利用特定的外源基因在哺乳动物体内表达获得人们需要的物质激素抗体酶食品工业开辟新是食品来源鸡蛋白基因导入大肠杆菌和酵母菌中畜牧养殖业120世界上第一只转基因动物能产药的奶牛转基因羊转基因鱼上面121本章结束本章结束此课件下载可自行编辑修改供参考
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
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第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
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（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。
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四、酵母细胞的克隆载体
♪1、整合型载体（YIP）
♪ YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA片段构成的。这类载体在细菌中复 制、扩增，进入酵母后可整合表达。 YIP型载体的特点是转化率低(只有110转化子/微克DNA)，但转化子遗传性 稳定，多用于遗传分析工作。
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3.M13噬菌体载体的优点
与其它载体相比，M13载体具有两个十分有用 的优点：
①这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶 基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位 点的序列。
②M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的， 可以有效地克隆双链DNA分子的每一条链。
2021/3/7
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三、柯斯质粒载体
sup-细菌
尾部基因 （琥珀突变型）
组装尾部所需要的组分 “无头部”的提取物
转录复制 蛋白质合成
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组装头部所需要的组分 “无尾部”的提取物
温育 完整的噬菌体
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二、M13噬菌体载体
M13是丝状噬菌体，有长约 6500个核苷酸的闭环DNA基 因组。M13附着在大肠杆菌 的F性菌毛上，所以它们只 能感染雄性细菌。不过M13 噬菌体DNA亦可通过转染作 用导入雌性大肠杆菌细胞。
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2、复制型载体（YRP）
♪ YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母 的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。 因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复 制基因，所以能在两种细胞中存在和复制
♪ 可以在两种截然不同的生物细胞中复制的 载体称为穿梭载体，穿梭载体在基因工程 中广泛使用。
分子克隆常用载体
➢质粒载体 ➢噬菌体载体 ➢柯斯载体 ➢酵母细胞的克隆载体
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一、质粒载体
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理想的质粒载体必须具备的基本条件
♪ 1、具有复制起点 ♪ 2、具有抗菌素抗性基因 ♪ 3、具有若干限制酶单一识别位点 ♪ 4、具有较小的分子量和较多的拷贝数
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重要的大肠杆菌质粒载体
♪ pSC101质粒载体； ♪ ColE 1质粒载体； ♪ pBR322质粒载体； ♪ pUC质粒载体；
♪ T载体
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pUCm-T质粒 图谱
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pUCm-T载体序列
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二、噬菌体载体
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噬菌体的生命周期
♪ （1）溶菌生长周期噬菌体（烈性 噬菌体）
♪ （2）溶源生长周期噬菌体（温和 噬菌体）
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（1）烈性噬菌体的生活周期
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（2）温和噬菌体的生活周期
裂解循环
溶源态
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重要的噬菌体载体
一、λ噬菌体载体
（1）插入型载体：有单一酶切点,便于外源DNA插入
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（2）替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之 间λ DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端 “尾巴”两部分组 成。
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2、Cosmid载体特点：
（1）具有λ噬菌体的特性（但因不含λ噬菌体的全部 必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子 代噬菌体颗粒）；
（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因 ）；
（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极 限可达45kb左右）；
（4）可产生大量纯化的含外源片断的单链DNA分子 。
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2.M13载体筛选方法
插入→α-多肽→互补于受体细胞→半乳糖苷酶 无色噬菌斑←不分解X-gal(IPTG)
未插入→α-多肽→互补于受体细胞→半乳糖苷酶 蓝色色噬菌斑←分解X-gal(IPTG)
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13λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体 DNA大小只能： 36kb ~ 51kb。
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体外包装：λ噬菌体载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比 裸露的DNA导入受体细 胞的效率高100-10000倍
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1.M13噬菌体作为载体优越性
（1）单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为 媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA。
（2）不论是RF DNA还是ss DNA，它们都能转染 感受态的大肠杆菌寄主细胞。
（3）单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的大小
制约的，因此不存在包装限制问题。
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