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第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作原理 第三章 基因疫苗抗原基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构建 第五章 基因疫苗制备第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素第九章 基因疫苗安全性第十章 细菌病基因疫苗第十一章 病毒病基因疫苗第十二章 寄生虫病基因疫苗第十三章 肿瘤基因疫苗第十四章 控制动物生长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。
其中，质粒是目前应用最为广泛的克隆载体。
下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。
（一）质粒特性质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。
有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。
有的质粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。
质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。
例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。
质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。
质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。
根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类型。
严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。
质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA（ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。
质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。
实验室常利用这些理化特性鉴定和纯化质粒。
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）［本章摘要］将外源DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。
质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。
它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。
质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。
常见的质粒载体有：pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如：pBluescriptⅡKS（±）。
λ噬菌体载体应用了λ噬菌体的生物学性质。
λ噬菌体有溶源状态和裂解循环两种状态，有着复杂的分子生物学调控机制。
λ噬菌体载体有大小、lacZ基因、cI 基因失活以及Spi 筛选等选择标记，分为插入型载体和置换型载体。
常见的插入型载体有：λgt10、λgt11及其衍生载体和λExcell 载体等。
常见的置换型载体有：EMBL3/4 及其类似载体，λgem-11 载体。
粘粒是带有cos 序列的质粒。
粘粒载体的工作使用了质粒和λ噬菌体的双重生物学性质。
常见的粘粒载体有：pJB8、pcos1EMBL 以及卡隆9 载体系列。
构建粘粒文库时会遇到许多困难，注意用对应的方法解决。
M13 噬菌体是一种单链噬菌体，基于其构建的载体可以制备单链DNA 。
常见的M13 噬菌体载体有M13mp18/19 ，其受体细胞有特殊的遗传标志。
带有丝状噬菌体大间隔区的质粒叫噬菌粒，噬菌粒工作的时候需要M13K07 辅助噬菌体的帮助。
人工染色体是一种高通量的载体。
Y AC 是基于酵母染色体生物学性质构建的载体，BAC 是基于 F 质粒的生物学性质构建的载体，PAC 是基于P1 噬菌体构建的载体。
大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。
常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A 和纤维素结合位点等。
分子克隆载体（vector）载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。
重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
它们的受体细胞都是大肠杆菌。
这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。
因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。
根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。
质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。
载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。
1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。
分子克隆实验指南分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。
这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。
分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤：1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。
2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。
3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。
4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。
5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。
下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考：1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。
2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。
3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。
4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。
5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。
6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。
7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。
8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。
9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。
总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。
质粒载体种类质粒载体是分子生物学实验中常用的工具，用于在细胞中携带外源DNA序列，并实现其在细胞内的复制和表达。
根据其结构和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型。
本文将介绍常见的几种质粒载体及其特点。
一、表达质粒载体表达质粒载体是常用的质粒载体类型之一，用于外源基因的表达。
其中，pUC18是常用的表达质粒载体，其大小为2686bp，含有多个重要的功能元件。
例如，pUC18包含了抗生素耐受基因，如AmpR基因，使得细菌能够在含有抗生素的培养基上生长。
此外，pUC18还包含了启动子、终止子和复制起始位点等重要序列，能够实现外源基因在细菌中的高效表达。
二、克隆质粒载体克隆质粒载体是用于基因克隆的质粒载体类型。
pBluescript II KS+是常用的克隆质粒载体，其大小为2960bp。
pBluescript II KS+含有多个克隆位点，如多克隆位点（MCS），能够方便地进行DNA片段的插入和克隆。
此外，pBluescript II KS+还包含了T7和T3启动子，使得插入的DNA片段能够通过转录和转录后修饰的方式进行进一步研究。
三、RNA干扰质粒载体RNA干扰质粒载体是用于RNA干扰实验的质粒载体类型。
pSUPER是常用的RNA干扰质粒载体，其大小为3144bp。
pSUPER含有特定的siRNA序列，能够通过RNA干扰技术抑制特定基因的表达。
此外，pSUPER还包含了启动子和选择性标记基因，使得转染细胞后能够通过选择性培养基筛选出抑制特定基因表达的细胞株。
四、双杂交质粒载体双杂交质粒载体是用于蛋白质相互作用研究的质粒载体类型。
pGBKT7和pGADT7是常用的双杂交质粒载体，分别用于检测靶蛋白的DNA结合活性和激活活性。
pGBKT7和pGADT7含有启动子、选择性标记基因和多克隆位点等重要元件，能够实现蛋白质相互作用的检测和分析。
五、表面显示质粒载体表面显示质粒载体是用于细胞表面展示外源蛋白的质粒载体类型。
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介二、分子克隆实验材料与设备三、分子克隆实验步骤1.设计引物2.合成目的基因3.构建表达载体4.转化受体细胞5.筛选转化子6.鉴定目的基因四、分子克隆实验注意事项五、实验结果分析与应用正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，通过复制特定DNA序列，将目的基因在受体细胞中稳定表达。
该技术在基因工程、生物科学等领域具有广泛应用，有助于研究基因功能、蛋白质表达及药物筛选等。
二、分子克隆实验材料与设备1.实验材料：DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液等。
2.实验设备：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、分子克隆实验步骤1.设计引物根据目的基因序列，设计一对互补的引物。
引物应具备一定的特异性，避免非特异性扩增。
2.合成目的基因利用PCR技术，以DNA模板为基础，通过引物扩增目的基因。
反应条件需根据所使用DNA聚合酶的要求进行优化。
3.构建表达载体将目的基因与载体DNA连接，形成表达载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4.转化受体细胞将构建好的表达载体转化到受体细胞中，如大肠杆菌、酵母等。
转化方法有化学法、电转化法等。
5.筛选转化子转化后的受体细胞在含相应抗生素的培养基上生长，筛选出含有目的基因的转化子。
6.鉴定目的基因对筛选出的转化子进行进一步鉴定，如DNA测序、基因表达分析等。
四、分子克隆实验注意事项1.实验过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.选择合适的引物长度和退火温度，以提高扩增特异性。
3.转化受体细胞时，注意操作力度，避免细胞损伤。
4.筛选转化子时，严格控制抗生素浓度，避免过度筛选。
五、实验结果分析与应用1.分析PCR产物，判断目的基因是否成功克隆。
2.鉴定目的基因的表达水平，评估实验效果。
3.将成功克隆的目的基因应用于基因敲除、基因表达等研究。
通过以上步骤，您可以顺利完成分子克隆实验。
实验过程中需严格操作，确保实验结果的准确性。
