基因的克隆、表达载体构建及功能验证Word版

传播优秀Word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！ 基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、 基因克隆 ★ 事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎ 实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备 ※ 基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化— 涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序

1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2) Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。 （4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。传播优秀Word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！ （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。 （8） 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。 （11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。 3） RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测 取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质量。

4） cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1） 在Eppendorf管中配制下列混合液： 试剂名称 使用量 模板RNA 1 µg Oligo dT primer (50 µM) 1 µl dNTP Mixture(10 mM) 1 µl RNase free dH2O up to 10 µl 2） 65 ℃保温15 min 后迅速在冰上急冷2 min。 3） 离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。 4） 在上述Eppendorf管中配制下列反转录反应液: 试剂名称 使用量 上述模板RNA/引物等的混合液 10 µl 5×Frist-Stand Buffer 4 µl RNase Inhibitor(40 U/ µl) 0.5 µl传播优秀Word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！ MTV RTase (10 U/μl) 0.5 µl RNase free dH2O up to 20 µl 5） 37 ℃保温60 min。 6） 95 ℃,5 min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。

1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取 （1）配制RNA抽提buffer，50 ml中含有： 1M Tris-HCl（PH 9.0） 2.5 ml 4MNaCl 1.5 ml 10%SDS 5 ml DEPC-H2O 41.25 ml （2）取以上RNA提取液650 ul，加350 ul水饱和酚，放入1.5 ml离心管中，65 ℃水浴预热。 （3）研磨0.3 g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约10 min。 （4）再加入400ul氯仿，抽提10 min，12000rpm 4 ℃离心10 min。 （5）取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇10 min，12000rpm 4℃离心10 min。 （6）取上清，加1/3体积的8 M氯化锂，4 ℃保存过夜。 （7）离心10 min，弃上清液，留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用无水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于80 ul DEPC水中。 （8）加入9 ul DNA酶(无RNA酶)，10 ul 10×buffer（DNA酶所带）和1 ulRasin（Rnas抑制剂），37 ℃ 30分钟（再加500 ul水） （9）取出用 300 ul氯仿和 300 ul苯酚抽提，摇10 min钟，静止10 min，12000 rpm 4 ℃离心10 min。 （10）取上清，加入等体积的氯仿，摇10 min，静止10 min，4 ℃离心10 min。 （11）取上清，加1/10 NaAC（3M，PH 5.2），再加2倍体积的预冷无水乙醇， -80 ℃冰箱过夜； （10）12000rpm离心15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80℃，备用。 2.2.2.1 cDNA第一条链的合成 （1）基因组DNA的去除反应 试剂 使用量 5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ul gDNA Eraser 1.0 ul传播优秀Word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！ Total RNA 5 ul RNase Free dH2O up to 10.0 ul 42 ℃ 2 min 4 ℃ 10 min (2) 反转录反应 试剂 使用量 5xPrimeScript@Buffer 2(for Real Time) 4.0 ul PrimeScript@RT Enzyme MixI 1.0 ul RT Prime Mix 1.0 ul ①的反应液 10.0 ul RNase Free dH2O up to 20.0 ul 37 ℃ 15 min 85 ℃ 5 sec 4 ℃ 10 min -20 ℃ 保存备用 2.基因cDNA克隆 2.1基因片段的PCR扩增 以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20ul：10×PCR Buffer 2.0 ul，2.5 mM dNTPs 1.6 ul，10 mM上下游引物各0.8 ul，Taq 酶0.3 ul，模板cDNA1.0 ul，ddH2O补足至20 ul。按照下列条件进行PCR扩增： 94 ℃ 4 min 94 ℃ 30 sec 50 ℃ 40 sec 30 cycles 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10 min 2.2 PCR扩增产物的检测和回收纯化 PCR扩增产物在1% 琼脂糖凝胶(含有 0.5 ug/ml溴化乙锭)上进行电泳，在紫外灯照射下进行观察，与标准分子量进行比较估测扩增DNA片段的大小，若与预计的大小相符，则使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下： 1) 在紫外灯下切下将要回收的条带(尽量使用长波长的UV)，称重。 2) 按每 100 mg 琼脂糖胶加入300 ul溶胶液PN，置于50 ℃水浴中 10 min，每隔2 min混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2 min。 3) 将UNIQ-10柱放入2 ml的收集管中，加入600 ul平衡液BL，13000rpm，离心30 sec。 3) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，静止2-3 min，13000rpm，离心30 sec。传播优秀Word版文档 ，希望对您有帮助，可双击去除！ 4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入700 ul漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心30 sec。 5) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入 500 ul漂洗液PW，13000 rpm离心30 sec，重复一次。 6) 取下UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中,13000rpm，离心2 min。 7) 将UNIQ-10柱放入一新的1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加50 ul预热70℃洗脱液EB，室温放置5 min。 8) 12000 rpm，离心l min，Ep管中液体即为回收的DNA片段，-20℃保存备用。 2.3 回收产物与PMD-T载体的连接与转化 采用TAKARA公司的PMD-T载体进行连接反应，感受态细胞DH5a作为转化细胞进行转化。具体操作步骤如下： SolutionI、PMD18-T或19-T、DNA回收产物置于冰中溶解。 在0.2ml离心管中配制反应体系10ul： PMD18-T 载体 0.5 ul SolutionI 5 ul 回收DNA产物 4.5 ul 混匀，16 ℃反应过夜（3h就可以）。 连接反应快结束时，从-80 ℃冰箱中取出DH5a感受态细胞，将离心管置于冰上使之融化。 1）取5 ul 的连接产物加到50 ul 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min。 2）将离心管置于42 ℃水浴90 s，间不要摇动离心管。取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min，其 3）向离心管中加入600-900 ul LB（不含抗生素）液体培养基，150r/min，37℃震荡培养60 min。 4）吸取150 ul 已摇好的菌液涂布在含有Amp(终浓度50 ug/ml)的LB固体培养基上，待液体完全被培养基吸收后，倒置平板，37℃，培养12-14小时。 2.4重组克隆的验证及序列测定 随机挑选5个左右单菌落于10 ml含50 ug/ml的LB液体培养基中，于恒温摇床37 °C，180r/min震荡培养过夜，培养至菌液OD600为0.6～0.8，用天根的质粒小提试剂盒提取质粒。也可按照下列步骤提取质粒： 1）将培养好的菌液倒入2.0 ml 离心管中，12000rpm离心1min，去掉上清液，再重复二次。 2）加入100 ul预冷的溶液P1涡旋使充分悬浮，室温静止5 min。 3）加入200 ul溶液P2，同一方向缓慢匀速转动离心管使溶液混合均匀，置冰上5 min。