为什么要先构建克隆载体再用表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。

这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。

一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。

最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。

1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。

但是并非T载体不能用来表达。

常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。

pGEM-T则含有T7和SP6启动子。

2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。

而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。

3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。

其实这里面大有学问。

学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

2022年吉林农业科技学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、放线菌的代表属有______、______、______、______等。

2、亚病毒包括______、______、______和______。

3、化能自养微生物例如______，它们的生物氧化和产能代谢等生理活动很难研究，其客观原因是它们的______效率低，______速率低，以及 ______得率低。

4、营养物质进入细胞的主要影响因素是______、______和______。

5、酵母菌的无性繁殖方式主要有______和______。

6、微生物学发展史上发展期的实质为______水平研究，其主要特征是：① ______，②______，③ ______，④ ______，⑤ ______。

7、消毒和灭菌的区别是______。

8、微生物寄生于其他微生物的例子如______、______；微生物寄生于植物的例子如______；微生物寄生于动物的例子如______。

9、普通性转导的基本要求是______，它可能出现的三种后果是______、______和______。

10、抗原与抗体间有八类主要反应，例如______、______、______和______等。

二、判断题11、支原体是已知的可以自由生活的最小的原核微生物。

（）12、有些假单胞菌可以利用多达90种以上的碳源物质。

（）13、反硝化作用是化能自养微生物以硝酸或亚硝酸盐为电子受体进行的无氧呼吸。

（）14、朊病毒（奇异病毒）是只含有侵染性蛋白质的病毒。

（）15、赤霉菌在分生孢子梗上可产生大小两种分生孢子，大分生孢子镰刀形，有3～5个横隔，它们通常单生或丛生在分生孢子梗顶端。

（）16、菌株的概念与克隆的概念相差甚远。

（）17、微生物在发酵罐内培养过程中，发生了培养基逐渐变酸而妨碍其代谢产物累积的现象，这时最好的措施就是不断地从外界加入NaOH或Na2CO3溶液去中和它。

2022年汕头大学生物技术专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、Anabaena azotica的异型胞通常是______生，在光学显微镜下它是______的，细胞两端有______。

它能控制______的进入，保持异型胞内______，以利于______。

2、病毒没有细胞构造，其主要成分为______和______两种，故又称“分子生物”。

3、面包酵母对游离葡萄糖非常敏感，高浓度葡萄糖抑制酵母的呼吸，导致酒精和有机酸生成，严重影响______，低浓度葡萄糖则可使酵母细胞产量明显增加，因而连续补加______就可控制发酵方向，高产出大量面包酵母。

4、微生物培养基中各营养要素的量有一定的比例，从含量最多的______开始，其他成分的次序是______、______、______、______和______。

5、酵母菌有性繁殖一般通过邻近的两个形态相同而性别不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起相互接触、局部融合并形成一条通道，再通过______、______和______形成四个或八个子核，然后它们各自与周围的原生质结合在一起，再在其表面形成一层孢子壁，这样一个个子囊孢子就成熟了，而原有的营养细胞则成了子囊。

6、微生物学的发展简史可分为______、______、______，现处于______。

7、在微生物培养过程中，会发生不利于其继续生长的pH变化，一般可采取两类方法作外源调节：① ______，过酸时可加入______或______ 等调节；过碱时，可加入______或______等调节；② ______，过酸时可通过______或______调节，过碱时可通过______或______调节。

8、磷的生物地球化学循环包括3种基本过程：______、______、______。

9、典型质粒的核酸分子是______，存在于质粒上的特定基因，使微生物获得了若干特殊功能，如______、______、______、______、______ 或______等。

2022年兰州大学生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、支原体是一类______、介于______和______之间的最小型原核生物，其中有一类专门感染植物的支原体，称为______。

2、温和噬菌体的存在形式有三种，即______、______和______。

3、光能自养微生物有产氧与不产氧两大类，前者如______等，后者如______等。

4、生长因子主要包括______、______和______，它们对微生物所起的作用分别是______、______和______。

5、真核生物的细胞核由______、______、______和______4部分组成。

6、要加速发展我国的微生物学，应努力从以下几个方面人手： ______；______；______；______等。

7、最常见的厌氧菌有① ______，② ______，③ ______，④ ______，⑤ ______，⑥ ______等。

8、在生命科学研究领域中，从宏观到微观一般可分10个层次，即______、______、______、______、______、______、______、______、______和______，其中前4个层次是生态学的研究范围。

9、外源DNA导入原核细胞可以采用以下3种方法：______方法，即重组质粒载体导入感受态细胞；______方法，即重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒导入感受态细胞；______方法，即外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒导入宿主细胞。

10、生物制品的内容可分四大类，即______，______，______和______。

二、判断题11、异染粒的化学成分是PHB。

（）12、细胞中的四种有机元素的干重占细胞干重的95%以上。

（）13、凡能进行硝酸盐呼吸的细菌，都存在着一条完整的呼吸链。

（）14、朊病毒（奇异病毒）是只含有侵染性蛋白质的病毒。

（）15、菌核和子实体都是由菌丝形成的。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。

② IG区内只有一个Bsu I 切点。

（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。

M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。

使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。

而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。

能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。

cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。

黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。

克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。

有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。

质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。

2022年广西师范大学生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、细菌的鞭毛是由______构成的，它从______长出，穿过______伸出体外。

2、病毒只有一种或少数几种酶，在寄主细胞外不能独立地进行______ 和______只有在活______中才表现生命活性，因而是严格的______生物。

3、一个葡萄糖分子经EMP途径后，可获得2分子______、2分子______ 和2分子中间代谢物______（其分子式是______）。

4、培养基的主要理化指标通常有______、______、______和______等数种。

5、曲霉分生孢子头的构造为：分生孢子梗的基部有一特征性的______，向上则分化出______、______、______和______，这四种总称为______。

6、微生物在资源开发上具有良好的发展前景，表现在：______，______，以及______等等。

7、常用的消毒方法有______，______，______等。

8、微生物间和微生物与它种生物间的主要关系有五种，即______、______、______、______、______。

9、艾姆斯试验中用的菌种是______的营养缺陷型______，通过回复突变可以测定待测样品中______的存在。

10、生物制品的内容可分四大类，即______，______，______和______。

二、判断题11、由于支原体细胞膜上含有甾醇，因此，它们对于抗真菌的抗生素很敏感。

（）12、被动扩散是微生物细胞吸收营养物质的主要方式。

（）13、利用运动发酵单胞菌进行细菌酒精发酵要比酵母菌酒精发酵时供应更多的氧。

（）14、腺病毒是一种呈二十面体对称的DNA病毒，在其包膜上，长有12个刺突。

（）15、掷孢酵母释放掷孢子的机制虽与担子菌释放担孢子相似，但前者是有性孢子，而后者则是无性孢子。

（）16、蛋白质氨基酸顺序的进化速率大体上是恒定的，但功能不同的蛋白质常以不同的速率进化。

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

2022年南通大学生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、蓝细菌是一类______、______、______和______的大型原核生物。

2、病毒的外壳为______，核心为______，两者共同组成______；有些较复杂的病毒还含有包膜，主要由______或______组成。

3、根据受氢体性质不同，可把生物氧化分为______、______和______ 三种类型。

4、从元素水平来看，微生物的有机氮源有______和______两类，无机氮源则有______、______和______三类。

5、真菌的孢子数量极大，给人类带来不利之处是______、______和______等；有利之处则是利于______、______、______、______和______等。

6、古生菌包括______、______和______等。

7、无菌室杀菌通常采用______和______相结合的方法。

8、清水中营养物浓度很低，所以清水中的微生物具有许多共同特征来适应环境，比如______、______和______等。

9、根据F质粒的不同情况可有______、______、______和______四种菌株。

10、免疫T细胞分为许多亚群，能协助特异性免疫反应的辅助T细胞是______，TS细胞叫______细胞，TM细胞又称______细胞。

二、判断题11、和动植物一样，细菌细胞也会经历由小长大的过程，因此，在相同情况下应选择成熟的细菌而非幼龄细菌进行显微镜观察，这样可以看得更清楚。

（）12、革兰氏阳性细菌比革兰氏阴性细菌有更高的渗透压。

（）13、硝酸细菌生命活动所需的ATP和[H]，是由水合亚硝酸（H2O·NO2－）脱氢，并分别经呼吸链和逆呼吸链传递后提供的。

（）14、在电子显微镜下可见到的每个病毒个体，都可称作病毒粒或病毒体。

（）15、从低等真菌、酵母菌到高等真菌，它们细胞壁中的多糖成分都是以几丁质为主。

构建基因表达载体的步骤基因表达载体是用来将外源基因转录和翻译为蛋白质的重要工具。

构建一个高效的基因表达载体是基因工程的重要一步。

下面将介绍构建基因表达载体的步骤。

第一步：选择合适的表达载体在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己研究对象的表达载体。

一般来说，常用的表达载体有质粒、病毒载体和细胞质表达系统等。

对于不同的表达载体，其表达效率和表达特点也有所不同，需要根据自己的实验需要进行选择。

第二步：选择合适的启动子和信号序列在表达载体中，启动子和信号序列是控制基因表达的关键元素。

启动子是转录起始位点上游的DNA序列，可以控制基因的转录水平；信号序列则可以控制基因的翻译和定位。

因此，在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己实验需要的启动子和信号序列。

第三步：克隆外源基因在构建基因表达载体时，需要将外源基因克隆到载体中。

一般来说，可以使用PCR扩增方法或限制性内切酶切割方法将外源基因克隆到载体中。

此外，还需要选择合适的克隆位点，以便快速筛选出正确的克隆子。

第四步：构建表达载体在将外源基因克隆到载体中后，需要构建表达载体。

具体操作包括将启动子和信号序列插入到载体中，以实现对基因表达的控制。

此外，还需要进行质粒线性化和酶切等操作，以实现转染或转化细胞。

第五步：筛选表达载体在构建表达载体后，需要进行筛选，以确定正确的表达载体。

此时可以通过限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序等方法进行筛选，以确保表达载体的正确性。

第六步：转染或转化细胞在确定正确的表达载体后，需要将其转染或转化到细胞中。

转染方法包括热激转染、电穿孔转染和基因炮转染等；转化方法则包括化学转化和电转化等。

根据自己的实验需要选择合适的转染或转化方法。

第七步：检测基因表达在转染或转化细胞后，需要检测外源基因的表达情况。

检测方法包括Western blotting、RT-PCR和荧光显微镜等。

根据自己的实验需要选择合适的检测方法。

总结构建基因表达载体是基因工程研究的重要一步。

为什么要先构建克隆载体再用表达载体构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。

为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为：①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。

尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。

②测序需要。

你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。

扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。

你要写论文必须要给人真凭实据。

先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。

很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。

单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。

同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。

先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。

怎么构建克隆载体和表达载体？首先根据你的实验需要选择相应的载体。

其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点，切记在载体上所选择的酶切位点要和你的基因序列上相一致，并且这两个酶切位点在你的基因序列中并不存在，否则会将基因切断再次就是对基因和载体进行酶切了，基因要是直接用带有酶切位点的引物进行PCR的话就不用再酶切了。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322与pUC的质粒复制起点与氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子与终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine与Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG与一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。