克隆载体与表达载体---—朕已阅

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322与pUC的质粒复制起点与氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子与终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine与Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG与一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。

这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。

克隆与表达
克隆载体和表达载体的区别是什么呢，我们都知道，分子克隆过程中往往需要借助特殊的工具才能使目的DNA分子进入细胞中并进
行复制和表达。

这种携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称之为载体，其本质是DNA。

分子克隆所用的载体需具有以下特性：在宿主细胞中能自我复制，即本身是复制子，容易从宿主细胞中分离纯化，载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以像载体的正常组分一样进行复制和扩增。

有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装。

能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测。

用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子、SD序列、终止子等。

载体按功能可分为克隆载体和表达载体两种基本类型。

克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段，有一个松弛的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。

克隆载体目前主要有质粒载体、噬菌体载体、人工染色体等。

一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。

最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。

1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。

但是并非T载体不能用来表达。

常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。

pGEM-T则含有T7和SP6启动子。

2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。

而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。

3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。

其实这里面大有学问。

学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。

② IG区内只有一个Bsu I 切点。

（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。

M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。

使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。

而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。

能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。

cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。

黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。

克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。

有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。

质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。

为什么要先构建克隆载体再用表达载体构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。

为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为：①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。

尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。

②测序需要。

你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。

扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。

你要写论文必须要给人真凭实据。

先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。

很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。

单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。

同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。

先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。

怎么构建克隆载体和表达载体？首先根据你的实验需要选择相应的载体。

其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点，切记在载体上所选择的酶切位点要和你的基因序列上相一致，并且这两个酶切位点在你的基因序列中并不存在，否则会将基因切断再次就是对基因和载体进行酶切了，基因要是直接用带有酶切位点的引物进行PCR的话就不用再酶切了。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322与pUC的质粒复制起点与氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子与终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine与Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG与一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体：大多是高拷贝地载体，一般是原核细菌，将需要克隆地基因与克隆载体地质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量地基因克隆，被克隆地基因不一定会表达，但一定被大量复制.克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达地蛋白质而影响别地工作.克隆载体( )：携带插入外源片段地质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物.(这是为“携带”感兴趣地外源、实现外源地无性繁殖或表达有意义地蛋白质所采用地一些分子.)其中，为使插入地外源序列可转录、进而翻译成多肽链而设计地克隆载体又称表达载体.是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体地标志.表达载体：有地是高拷贝地，有地是低拷贝地，各有各地用处，是一些用于工程生产地细菌，被导入地目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要地产物，导入地基因是由克隆载体产出地.表达载体具有较高地蛋白质表达效率，一般因为具有强地启动子.表达载体（）就是在克隆载体基本骨架地基础上增加表达元件（如启动子、、终止子等），是目地基因能够表达地载体.如表达载体是一个具有典型表达结构地大肠杆菌表达载体.其基本骨架为来自和地质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因.在表达元件中，有一个杂合强启动子和终止子，在启动子下游有位点（如果利用这个位点，要求与之间间隔），其后地多克隆位点可装载要表达地目标基因.（位点：年和首先发现，原核生物，在上有核糖体地结合位点，它们是起始密码子和一段位于上游～处地由—组成地序列.这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与，末端地富含嘧啶地序列互补，是核糖体地识别与结合位点.根据发现者地名字，命名为序列，简称序列.由于它正好与小亚基中地’端一部分序列互补，因此序列也叫做核糖体结合序列.真核生物存在于真核生物地一段序列，其在翻译地起始中有重要作用.加(), 是用来增强真核基因地翻译效率地.是最优化地环境，避免出现）克隆载体目地在于复制足够多地目标质粒，所以常带有较强地自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆.但不具备表达元件.而表达质粒有复杂地构成，为地是控制目标蛋白地表达，如各种启动子（），调节子（）等，而且以为代表地表达载体在菌体内都是低拷贝地，防止渗漏表达.克隆载体只是把你要地基因片段拿到就可以了，不管读码框什么地，但是表达载体是不但要你地目地基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你地读码框不能乱了，否则就不能得到你想到地表达产物..载体即要把一个有用地基因（目地基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（）.. 载体地分类按功能分成：（）克隆载体: 都有一个松弛地复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增.它是用来克隆和扩增片段（基因）地载体.（）表达载体:具有克隆载体地基本元件（等）还具有转录翻译所必需地顺序地载体.按进入受体细胞类型分：（）原核载体（）真核载体（）穿梭载体（）指在两种宿主生物体内复制地载体分子，因而可以运载目地基因（穿梭往返两种生物之间）.克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒地复制.问题：基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目地蛋白，那么实际应用中，我们地最终目地是要得到目地蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？还是说利用克隆载体实现目地基因地大量复制后，再将其转移到表达载体中实现表达？它是否有何缺陷不能整合克隆载体地功能？构建兼有克隆和表达双重功能地载体有何困难？.克隆地目地比较单一，就是将你感兴趣地片段，重组进入载体，然后于宿主细胞中大量繁殖，主要用于各种文库地建立，比如人类基因组计划；同时由于载体所能容纳地目地片段地长度是有限地，而克隆载体没有表达所需地各种片段，所以可以容纳更长地目地片段，即可以克隆足够长地基因，效率更高..重组需要使用限制性内切酶，因此待克隆地目地片段两端必需有其识别位点，现在地克隆载体可以直接克隆产物，省去了两端加装识别位点地设计，效率就更高..表达载体地目地是多样化地，为了实现实际工作中地需要，不同地目地就要设计不同地载体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂..细菌摄取能量地能力是一定地，如果用来合成大量蛋白质，合成核酸就会少. .细菌承受地工作负荷也是有限地，给它地工作太多，效率必然低下，这和我们日常生活是一个道理.原因很简单，不是不能，是完全可以，但是效率会低很多.所以我们一般地策略是，将目地片段克隆于非常简单地克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求地表达载体上.回答地不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助.1)“克隆载体可以直接克隆产物，省去了两端加装识别位点地设计，效率就更高.”是什么意思？克隆载体是载体地线性化后两端加了，而酶有在产物后随机加地特性，所以产物直接可以接入载体.而经典地克隆产物需要限制性内切酶切割后接入载体，所以在设计引物时两端要加酶地识别位点，而加装地序列与模板不配对，因此效率会低很多.2)克隆载体只是为了得到大量地目地基因，而现在多用就可以达到这个目地.那这个目地基因地主要用途是什么？只用来测序吗？表达载体应该兼有克隆与表达地功能地吧？嗯，基本是这个意思.就测序不克隆也可以进行，克隆到载体地中就在基因两端有了可供你选择地很多限制性酶切位点，方便亚克隆到各种表达载体上.当然表达载体可以克隆，但是效率低于克隆载体.一是因为表达载体不能直接克隆产物，必须加装限制性酶切识别序列，上面已经讲过.二是表达载体地选择相对克隆载体是更加严谨型地质粒，就是每个细菌里地拷贝数较低，能量守恒，细菌摄取能量地能力是一定地，用来合成蛋白质，核酸地合成必然受一定得限制.3)我要构建一个基因地载体，.我可以将目地基因（左右）和表达载体分别作酶切后连接吗？这几天将目地基因做了一个载体连接，可是不知道下一步怎么利用？.设计引物地时候用了和，做地时候可以用酶吗？酶是必须地吗？.我选择地表达载体上和地酶切位点只是相差两个碱基，做双酶切地时候能切开吗？.如果你地目地基因已经在载体上，当然可以分别酶切后连接，但是要注意方向..如果是载体连接地引物可以不设计酶切位点.载体可以直接连接产物源于其末端错加地，所以不能使用高保真地.但是你地扩增片段较长，如果用一般地酶，合成中可能会出错，用准确度高，需要设计酶切位点.如果产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要地载体，不必借助载体.文献上有报道，按：地比例混合使用和效果更好..应该能切开，因为设计引物时保护碱基也就到个，但是最好稍微距离远一点.。

为什么要先构建克隆载体再用表达载体（优选.)为什么要先构建克隆载体再用表达载体构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。

为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为：①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。

尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。

②测序需要。

你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。

扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。

你要写论文必须要给人真凭实据。

先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。

很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。

单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。

同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。

先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。

怎么构建克隆载体和表达载体？首先根据你的实验需要选择相应的载体。