克隆载体与表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。

这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。

最新为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体备课讲稿为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体构建克隆载体是⼤量扩增DNA⽚段，⽤以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是⼤量得到翻译产物——蛋⽩质。

为什么要先构建克隆载体，再⽤表达载体，我猜是因为：①得到⼤量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做⼀次常规的PCR，⽽且每次都要重新提DNA和RNA才⾏，⽽且，PCR反应的试剂盒⼜不便宜，⽤PCR来制备⼤量DNA有点得不偿失。

尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极⾼，⽽且还要筛选，但⼀旦你重组成功并转⼊了⼤肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候⽤，摇个菌，就可以制备到⼤量的DNA。

②测序需要。

你想转表达，你⾸先得确定你扩增的⽬的⽚段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark 的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。

扩增出的基因⽚段保险起见或者经费允许，要拿去测序，⽽⼀般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上⼀般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。

你要写论⽂必须要给⼈真凭实据。

先构建克隆载体再构建表达载体并不是⼀个必须的选择，如果你的扩增PCR⽬的条带很亮，⽽且单⼀性很好，我建议你可以直接克隆进⼊表达载体。

很多⼈选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时⽬的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进⾏测序，增加测序的准确度，从⽽确认⾃⼰克隆基因序列的正确性。

单纯的PCR产物往往是⼀些各种PCR⽚段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。

同时保存的PCR⽚段⽐较容易降解，⽽构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。

先构建克隆载体，⼀是为了便于测序，确认克隆序列正确，⼆是为了便于基因PCR⽚段的保存。

怎么构建克隆载体和表达载体？⾸先根据你的实验需要选择相应的载体。

基因克隆载体有什么用途
1.基因表达载体：基因克隆载体被用来将感兴趣的基因克隆到表达主
机中。

通过将基因与适当的调控序列结合，如启动子、增强子和终止子等，可以实现对基因的调控和表达。

这种表达基因的载体在生物制药、蛋白质
生产以及基因治疗等领域有广泛的应用。

2.基因敲除载体：基因克隆载体可以用于基因敲除研究，即通过将目
标基因的编码序列替换或删除，实现对基因功能的研究和破坏。

这种方法
可以用来揭示基因在生物发育、生理过程和疾病发生中的作用和机制。

4. RNAi载体：基因克隆载体还可用于RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术研究。

通过将特定的RNA序列克隆到载体中，可以实现对目标
基因的特异性抑制，进而揭示基因功能和信号传导途径。

5.DNA库构建：基因克隆载体也可以用于构建DNA库，即将一组基因（如全基因组）克隆到载体中形成文库。

这种文库可以用来筛选和分析目
标基因，加快新基因发现和功能研究的进程。

此外，基因克隆载体还可以用于分子标记和荧光报告基因的构建，以
及基因转导、基因传递和转基因生物的制备等方面。

总的来说，基因克隆
载体是基因工程研究中的重要工具，可以实现对基因的调控、研究和应用，对生物学研究、生物技术开发和医学治疗等领域具有重要的推动作用。

一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。

克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。

(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。

)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。

表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。

表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。

这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。

克隆载体的名词解释克隆载体是分子生物学实验中常用的工具，用于携带并负载外源DNA片段，以实现基因克隆和基因工程。

克隆载体可由天然或人工合成的DNA构建而成，广泛用于基础研究、基因表达、基因治疗等领域。

本文将从克隆载体的定义、组成结构、常见类型以及应用等方面对其进行解释。

一、克隆载体的定义克隆载体是指用于将目标外源DNA导入到宿主细胞或有机体中，并在其中进行自主复制、表达和传递的DNA分子。

克隆载体具有一系列特定的序列和功能元件，包括起始子、终止子、选择标记、荧光蛋白等，以确保成功实现目标DNA的克隆和表达。

二、克隆载体的组成结构克隆载体通常由一个或多个元件组成，包括DNA序列、选择标记、表达载体以及复制起源，具体结构如下：1. DNA序列：克隆载体内含有目标外源DNA的序列，其大小和类型因实验需求而异。

DNA序列通常具有特定的限制性内切酶切位点，以便于将外源DNA片段定向插入到载体中的特定位置。

2. 选择标记：为了筛选成功克隆和转入宿主细胞的载体，克隆载体通常携带有选择标记基因，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。

这些标记基因在宿主细胞中可以提供对抗生素的耐药性或特定荧光表达，从而方便筛选出含有目标外源DNA的成功克隆载体。

3. 表达载体：对于需要进行表达的克隆载体，其内部还包含有启动子、终止子以及表达宿主基因的相关元件。

这些元件协同作用，使得克隆载体能够在宿主细胞中进行基因的转录和翻译，从而实现目标基因的表达。

4. 复制起源：为了保证克隆载体能够在宿主细胞中独立复制，克隆载体通常还含有复制起源序列。

复制起源序列可以与宿主细胞的复制系统相互配合，使得克隆载体能够被复制并遗传到下一代细胞中。

三、克隆载体的常见类型克隆载体具有多种类型，根据其应用和特性的不同，常见的克隆载体包括质粒、噬菌体、合成DNA以及病毒载体等。

1. 质粒（Plasmid）：质粒是环状的双链DNA分子，常见于细菌和真核生物中。

质粒通常具有小分子大小（约1-10 kb），较容易复制和操纵。

克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。

② IG区内只有一个Bsu I 切点。

（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。

M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。

使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。

而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。

能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。

cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。

黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。

克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。

有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。

质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。

基因载体和工具酶：基因载体可分为克隆载体和表达载体两种，其中克降载体必需具备如下条件：①具有复制原点，在宿主细胞内必需能够自主复制；②有一条或多条用于筛选的选择标记，易于识别和筛选；③具备合适的限制性核酸内切醐的单一识别位点，便于外源DNA片段的插入，同时不影响其复制；④有较高的拷贝数，便于目的基因的大量制备；⑤具有较大的外援DNA片段装载容量，又不影响本身的复制。

表达载体必需具备如下条件：①具备与克隆载体相同的复制起点、多克隆位点和筛选标记基因；②具备掌握目的基因表达的调控序列，包括启动子、转录终止子；③具备完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点。

工具酶包括限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶类、碱性磷酸酶、末端脱氧核甘酸转移防以及其他工具的。

基因工程诞生的理论基础：三大理论基础：①发觉了生物的遗传物质是DNA而不是蛋白质；②明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制基质；③遗传密码子的破译。

三大技术基础：①采用限制性内切酶和DNA连接酶外切割和连接DNA片段；②质粒改造成载体以携带DNA片段克隆；③逆转转录酶的食用打开真核生物基因工程的一条通道。

胚胎原位杂交技术、Northern杂交、blot的异同点：相同点：①都是用带有标记的核酸探针，与待测核酸（RNA）片段进行杂交；②都要对进行了杂交处理的材料进行漂洗；③都要对杂交信号进行检测。

不同点：①用于标记的核酸探针种类不同：胚胎原位杂交所用探针分为DNA探针、RNA探针、cDNA 探针和寡核甘酸探针等，DNA探针还有双链和单链之分。

依据标记方法的不同也可分为放射性探针和非放射性探针：对于Northern/blot而言，其探针为同位素或生物素标记的DNA或RNA探针对固定于膜上的mRNA进行杂交。

②胚胎原位杂交需要两条恒氨酸单链片段，在相宜条件下，能形成DNA-DNA. DNA-RNA或RNA-RNA双链分子；而Northern、blot则是针对RNA样品。

植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得实习生：李宇皓，实习时间为2017年11月27日-12月25日。

这次实习是去农学院，具体是一个专业—园艺科学。

这是我第三次参加此类型的实习了。

前两次都是上课的形式，今天终于亲自动手操作了！还不错吧!这也算是我实践性比较强的一门课了。

实习内容包括有：《植物基因组文库构建》、《植物多样性》、《植物基因组工程与应用》、《植物抗病虫害》。

最后进行分组讨论会，向指导老师汇报成果，感觉很棒啊！从10月30号到12月13号，五天时间里，我们几个同学根据实际情况，做好各项准备，完成了毕业设计的前期任务，并在第六周开始正式着手整个课题的研究工作，可谓万事俱备只欠东风了！
实验目的和要求：1.掌握植物基因组文库构建方法2.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的方法3.掌握基因组文库构建与高密度筛选4.熟悉多克隆抗体技术5.理解基因工程原理6.通过外源基因表达产物对花卉新品种的选育作用以及利用反义技术实现基因定位和标记
等相关问题。

实习步骤（含内容）：实习一：了解植物基因组文库构建概念及意义；制定实验方案；进行文库构建；并利用文库分析植物进化史。

实习二：分离转录间隔区序列；目的基因与其他基因的分离纯化；目的基因的克隆及转化载体构建；目的基因的 PCR 扩增、测序与分析；目的基因片段的克隆；基因片段的连接；基因文库构建及质量检查。

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