当前位置：文档之家 › 第二章 酶学基础2

第二章 酶学基础2

  • 格式：ppt
  • 大小：737.00 KB
  • 文档页数：76

下载文档原格式

  / 76

合集下载

蛋白质与酶工程复习资料

蛋白质与酶工程复习资料

酶工程复习提纲第一章绪论1.酶及酶工程的概念。

酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。

酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。

(名词解释) 2.了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。

1833年，Payen和Persoz发现了淀粉酶。

1878年，Kuhne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。

给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中”。

1902年，Henri提出中间产物学说。

1913年，Michaelis and Menton推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。

1926年，Summer分离纯化得到脲酶结晶。

人们开始接受“酶是具有生物催化功能的蛋白质”。

Cech and Altman于1982和1983年发现具有催化活性的RNA即核酸类酶，1989年获诺贝尔化学奖。

现已鉴定出5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。

3.了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。

医药：（1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。

（2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。

（3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。

食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、担子菌）；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普鲁兰酶、糖化型α-淀粉酶（枯草杆菌）。

Chapter 2 酶 section1

Chapter 2 酶 section1

3.酶与底物结合形成中间络 合物的方式（理论）
(1)锁钥假说(lock and key hypothesis)： 认为整个酶分子的天然构象 是具有刚性结构的，酶表面 具有特定的形状。酶与底物 的结合如同一把钥匙对一把 锁一样
(2)诱导契合假说（induced–fit hypothesis): 该学说认为酶表面并没有一 种与底物互补的固定形状， 而只是由于底物的诱导才形 成了互补形状.
OH
CH2 CH2 NH2 OH
亲核性基团
酸碱性基团
(3)酶原和酶原的激活： （P421） 酶原：没有活性的酶的前体。 酶原的激活：酶原在一定条件下经适当的物质作用可转变 成有活性的酶。酶原转变成酶的过程称为酶原的激活。 本质：酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的不可 逆过程。 如：胰凝乳蛋白酶原的激活 P421－422
mRNA
–
多肽 亚基
点样线
M4 M3H M2H2
MH3
四聚体 H4
+
三、酶的命名及分类
1. 酶的命名 (1)习惯命名法: 1. 根据其催化底物来命名：如淀粉酶； 2. 根据所催化反应的性质来命名：如水解酶； 3. 结合上述两个原则来命名：如琥珀酸脱氢酶； 4. 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它 特点：如胃蛋白酶。
(2)必须基团( 表10－1)：酶表现催化活性不可缺少的基团。 原因：①底物主要靠氢键、盐键、范德华力、疏水作用与E作用；②反应涉 及电子或/和质子的转移；③以AA的R基或辅酶为媒介。

亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。 酸碱性基团：天冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟 基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。

(整理)第二章酶

(整理)第二章酶

第二章酶第一节酶的一般概念一. 酶的概念：酶是由生物活细胞产生的，具有高度专一性和极高催化效率的生物催化剂。

◆在生物体内，存在着很多酶：如胃蛋白酶、丙酮酸脱氢酶、己糖激酶等等。

◆对整个新陈代谢的协调、调节，都是通过酶的调节进行的，一旦酶的调控失调，代谢就会紊乱，引起疾病或死亡。

如：有机磷农药的中毒、KCN、CO等的中毒。

二. 酶的化学本质1926年, Sumner从刀豆分离到脲酶结晶,并证明酶是蛋白质,证据：1．由氨基酸通过肽键连接而成2．具有一、二、三、四级结构3．有两性电解质的性质：阴、两性、阳离子形式4．受物理、化学等因素影响而变性失活5．水溶液具有胶体性质6．能被蛋白酶水解，氨基酸顺序已搞清楚，可人工合成•酶非蛋白质证据80年代,Cech和Altman发现L19RNA具有多种酶的催化功能，这说明有催化作用的生物催化剂不一定是蛋白质。

将这类具有催化作用的RNA称为ribozyme（核酶）三.酶的催化特性（一）酶具有很高的催化效率•比一般化学催化剂高107～1013倍,比非催化反应高108～1020倍。

(二)酶具有高度的专一性(specificity)专一性(specificity)——酶只作用于一类化合物或一定的化学键，催化一定类型的化学反应，并生成一定的产物。

底物(S)——通常把酶作用的反应物称为底物（substrat）。

1．绝对专一性(absolute ～)：只能催化一种底物发生一定类型的反应。

如脲酶2．相对专一性(relative ～)：酶能作用于一类底物或一种化学键, 又分键专一(作用于共价键)和基团专一(对基团有选择)。

1）如脂肪酶（键专一）：2）蛋白酶（基团专一）：3．立体专一性立体专一性（stereochemical ～）——作用于底物立体异构体中的一种。

（三）反应条件温和常温（体温）、常压（1个大气压）、pH值近中性。

（四）酶易变性失活高温、强酸碱等条件下容易变性失活（五）体内的酶活性是受调控通过激素、激活剂和抑制剂对酶活性进行调节。

第二章酶学概论

第二章酶学概论

第二章酶学概论酶的分类、组成、结构特点和作用机制第二节酶作为催化剂的显著特点第三节酶抑制作用的概念和分类第四节酶的活力测定第一节酶的分类、组成、结构特点和作用机制一.酶的分类与命名二.酶的组成和结构特点三.酶的作用机制一、酶的分类与命名(一)酶的命名1、推荐名：酶底物，名称加后缀“ase”. 如：脲酶(urease)2、系统名：国际公认的酶命名系统酶①氧化还原酶②转移酶③水解酶④裂合酶⑤异构酶⑥连接酶即：底物名称+催化反应的类型(二)国际系统分类法和编号根据国际命名系统，每种酶都有一个独自的4 个数字的分类编号，如：胰蛋白酶：EC:3、4、21、4 3:表示它为水解酶4:表示它为蛋白酶水解肽键21:表示它为丝氨酸蛋白酶，在活性部位上有一至关重要的丝氨酸残基。

4:表示它为这一类型中被指认第四个酶。

(三)酶的分类1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂合酶5.异构酶6.连接酶(合成酶) 7.核酸酶(催化核酸)1.氧化还原酶(Oxidoreductase) 包括脱氢酶(Dehydrogenase) 、氧化酶(Oxidase) 、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等C H 3C H C O O H OH N AD+C H 3C C O O H ON AD HH+2.转移酶(Transferase) 包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等C H 3C H C O O H N H2 C H 3C C O O H O H O O CC H 2C H 2C C O O H O H O O C C H 2C H 2C H C O O H N H23.水解酶(Hydrolase) 脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶RC O O C H 2C H 3H 2ORC O O HC H 3C H 2O H4.裂合酶(Lyase) 这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。

第二章 酶学概论

第二章 酶学概论

♦ 新陈代谢是由无数个成系列，相连锁、 新陈代谢是由无数个成系列，相连锁、
相交叉的化学反应组成的， 相交叉的化学反应组成的，即在每个活 细胞中均有一个新陈代谢网。 细胞中均有一个新陈代谢网。那么这些 反应如何有条不紊的进行呢？ 反应如何有条不紊的进行呢？大家都知 就是因为有诸多酶的存在， 道，就是因为有诸多酶的存在，由于酶 的调控，才使EMP、TCA、PPP（HMP、 的调控，才使 、 、 （ 、 HMS）、 的降解、尿素的产生、脂肪 ）、Pr的降解 ）、 的降解、尿素的产生、 的分解、 的降解等等顺利进行， 的降解等等顺利进行 的分解、NA的降解等等顺利进行，小小 的酶是功不可没的。 的酶是功不可没的。
酶是生物体活细胞产生 的具有一定催化能力的Pr 的具有一定催化能力的 or NA。 。 最初称之为酵 素（Ferment），现统称为 ），现统称为 ）， 酶（Enzyme）。 ）。
♦ 酶可以说是生命活动中最重要的因素， 酶可以说是生命活动中最重要的因素，
它是生命的机动者和调节者， 它是生命的机动者和调节者， 是体内一 切化学反应的媒介。因此没有酶的作用， 切化学反应的媒介。因此没有酶的作用， 生命活动就一刻也不能进行， 生命活动就一刻也不能进行，没有酶的 催化，生命的发生也就不能实现。 催化，生命的发生也就不能实现。 ♦ 现代生命科学的兴起，有赖于生物化学 现代生命科学的兴起， 的发展，没有酶就没有新陈代谢， 的发展，没有酶就没有新陈代谢，没有 新陈代谢也就没有生命活动。 新陈代谢也就没有生命活动。世间万物 将不复存在。 将不复存在。
三、应用酶学
♦ 3、修饰酶：用一些物理或化学的方法修 、修饰酶：
饰某些酶， 饰某些酶，使其具有特殊的构象和特异 的功能，使其半衰期更长， 的功能，使其半衰期更长，以达到应用 的目的。 的目的。 ♦ 4、固定化酶：采用一些物理或化学的方 、固定化酶： 使酶固定化，便于利用和回收， 法，使酶固定化，便于利用和回收，从 而大大提高酶的利用率。 而大大提高酶的利用率。

第二章 食品酶学_PPT幻灯片

第二章 食品酶学_PPT幻灯片

辅酶：结合松散，易透析除去。
辅基：结合紧密，不易透析除去。
食品化学
FOOD CHEMISTRY
第二章 食品酶学
根据结构不同酶可分为： 单体酶：
只有单一的三级结构蛋白质构成。 寡聚酶：
由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成。 多酶复合体：
由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。
食品化学
FOOD CHEMISTRY
绝大多数的酶是蛋白质，具有蛋白质的一切理化性 质。按组成可分为： 单纯酶 结合酶（全酶）
食品化学
FOOD CHEMISTRY
第二章 食品酶学
单纯酶：
仅由蛋白质组成，水解的最终产物是氨基酸，如胃 蛋白酶，脉酶，木瓜蛋白酶。
结合白酶（全酶）：
由酶蛋白和辅助因子结合。
辅助因子包括包括金属离子和有机小分子，有机小 分子包括辅酶和辅基，一般是结构复杂的有机化合物。
食品化学
FOOD CHEMISTRY
第二章 食品酶学
2、底物浓度对酶促反应的影响
在酶浓度、pH、温度等条件
不变的情况下研究底物浓度和反 反
应速度的关系。如右图所示：
应
在低底物浓度时, 反应速度 与底物浓度成正比，表现为一级
速 度
反应特征。
当底物浓度达到一定值，几
乎所有的酶都与底物结合后，反
应速度达到最大值（Vmax），
FOOD CHEMISTRY
第二章 食品酶学
第三节 酶促反应动力学
酶促反应动力学是研究酶促反应速度及影响反应速度 的各种因素的科学，对于深入了解酶催化作用的本质、机 制以及对于酶的分离纯化及应用等方面都具有重要意义。
1、酶浓度对酶促反应的影响
当底物充足，其它因素不变，并且反应系统中不含 有抑制酶活性的物质及其它不利于酶发挥作用的因素时， 反应速率与酶浓度成正比；底物浓度不足或酶浓度过高、 产物积累对反应有抑制作用，会妨碍反应速率；实际生 产中，酶浓度如过高，既浪费又影响产品质量。

第二章 酶抑制剂及反应动力学

第二章 酶抑制剂及反应动力学
❖ 失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分 或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性， 导致部分或全部丧失活性。
2. 抑制作用
❖ 抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基 团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的 降低或丧失。
3. 去激活作用
❖ 去激活作用，某些酶只有在金属离子存在下才有 活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低 或丧失。去激活作用通过去除金属离子而间接地 影响酶的活性。当金属离子去除后，底物与酶的 结合减少，实际上是降低了底物的有效浓度。
❖
来源广泛，种类多
❖
适合大规模生产
❖
微生物体内，两者共存，为寻找
酶制剂指明方向
❖ 2组合化学法 ❖ 基于化学合成与计算机技术相结合的组合化学法
是酶抑制剂筛选的全新方法,其基本原理是借助组 合合成仪同时合成出大量不同化合物,并通过高通 量群集筛选技术得到最有潜力的先导物.
❖ 3高通量筛选法 ❖ 高通量筛选法是在传统筛选技术的基础上,将先进
分子水平的药物筛选模型:受体筛选;酶筛选;离子通道筛选. 细胞水平药物筛选模型:细胞调亡;转录调控;信号传导;细菌生长;细 菌蛋白分泌
第三节 有抑制的酶反应动力学
一：双曲线：1902年，研究蔗糖酶催化蔗糖水解 反应
第一段：一级反应 反应速度只与反应物浓度一次方成正比 第二段：混合反应 第三段：零级反应 反应速度与反应物浓度无关
构建抗除草剂工程植物机理 （3）降低植物作用靶酶对除草剂的敏感性
突变avoA基因，它合成的EPSP酶的脯氨酸被丝 氨酸所取代，酶的活力不受影响，但是对非选择性 除草剂草甘膦的结合力只有原来的25%，从而使 植物对除草剂表现不敏感。
三 酶制剂的制备
❖ 1产酶抑制剂的微生物

生物反应工程 第二章

生物反应工程 第二章

2.2 均相酶促反应动力学 2.2.1 酶促反应动力学基础 可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。 对酶促反应 ，有：
式中， k：酶促反应速率常数； r：酶促反应速率； rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率； rP：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率。
对连锁的酶促反应，
2.2.2 单底物酶促反应动力学 2.2.2.1 米氏方程 根据酶－底物中间复合物假说，对 单底物酶促反应 ，其反应机制可 表示为：
根据以上假设，可建立如下方程组
解之，得
令 则
米氏方程 r
rmax
rmax/2
Km
CS
图2－1 酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响
对米氏方程的讨论： • 当CS<<Km时， ，属一级反应。
• 当CS>>Km时，
，属零级反应。
• 当CS＝Km时， 。Km在数量上 等于反应速度达到最大反应速度一 半时的底物浓度。
解之,得
式中:
稳态法推导动力学方程:
解之,得
式中:
可见,产物抵制属于竞争性抵制
底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓 度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底 物抑制。 r
CS
CS
底物抑制反应机理：
快速平衡法推导动学方程：
解之,得
式中:
双倒数法(Linewear Burk): 对米氏方程两侧取倒数，得
,以 作图，得一直线， 直线斜率为 ，截距为 ,根据直线 斜率和截距可计算出Km和rmax。
1／r
1／rmax
斜率－Km/rmax
－1／Km
1／CS
图2－2 双倒数法求解Km和rmax
2.2.2.2 抑制剂对酶促反应速率的影响 失活作用 抑制作用 竞争性抑制 非竞争性抑制

第二章酶催化的基础知识

第二章酶催化的基础知识

4.氨基酸的空间分布
表面氨基酸—多为亲水性氨基酸； 活性中心——多为疏水性氨基酸
活性部位位于凹陷处
5.酶分子的柔顺性
构象1 构象2 构象1
二、酶的组成
仅由氨基酸组成，没有辅助因子
单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。 （简单蛋白质） 除了在其组成中含有由氨基酸组成 酶 酶蛋白 （apoenzyme） 双成份酶 辅酶（coenzyme) （结合蛋白质） 辅因子 （cofacter) 辅基(prosthetic group) 小分子有机物
2. 诱导契合学说
酶与底物结合时相互诱导发生构象改变
诱导契合学说
• 该学说认为酶表面并没有一种与底物互 补的固定形状，而只是由于底物的诱导 才形成了互补形状.
Arg145胍基 Tyr248-OH Glu270- COO-
底物
羧 肽 酶 的 诱 导 契 合 模 式
第四节 酶活力测定
• 酶的活性 是指酶催化化学反应的能力， 其衡量标准是酶促反应速度的大小。
催化效率高的本质： 活化能大大降低
E1
能 量 水 平
ES
E2
E+S
G
E-酶 S-底物 P-产物 ES-酶与底物的复合物
P+ E
反应过程
能 量 结合能 非催化反应活化能
一般催化剂催 化反应的活化能 酶促反应 活化能
底物
反应总能量改变
产物 反 应 过 程
酶促反应活化能的改变
ES
中间产物学说
S P
国际命名的特点 （1）表达准确，科学 而严谨。 （2）太繁，使用起来 不太方便。
三 核酸酶的命名
• 核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特 殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯 键的水解及其逆反应。

生物化学第二章酶ppt课件

生物化学第二章酶ppt课件

叶酸和叶酸辅酶 ⑦ 酶原转变成酶的过程称为酶原的激活。
酶全催酶化 (ho作lo用en的zy中m维间e）产生=（酶络蛋素合白）B+物辅1学1因说又子 称叶酸，作为辅酶的是叶酸加氢的还原产 物四氢叶酸。 (3)抗体酶（abzyme）：
(3)酶原和酶原的激活
根据其催化底物来命名；
H 维生素B6包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。
多数维生素维生素作为辅酶和辅基的组成成分，参与体内 的物质代谢。
维生素一般习惯分为脂溶性和水溶性两大类。其中脂溶性 维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生 素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。
某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催 化作用，这类分子被称为辅酶（或辅基）。
(2)传递氢（递氢体）：如 硫辛酸；
FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、
(3)传递酰基体：如 C0A、TPP、硫辛酸； (4)传递一碳基团：如 四氢叶酸；
(5)传递磷酸基：如 ATP，GTP；
(6)其它作用： 转氨基，如 VB6 ；传递CO2，如 生物素。
维生素和辅酶
维生素是机体维持正常生命活动所必不可少的一类小分子 有机物质。
OH OH
OHOHOH O
CH2CHCHCHCH2OPOCH2 O
N
N
NN
OH
CH3
CO
N
N
CH3
NH
NC
NH2
O
FMN
FAD
③ 泛酸和辅酶A（CoA）
维生素B3又称泛酸，是由,-二羟基---二甲 基丁酸和一分子-丙氨酸缩合而成。
CH3OH O
O
CH2 C CH C NH CH2 CH2 C COOH

第二章酶总结

第二章酶总结

第二章酶总结第一节酶是生物催化剂一、酶是生物催化剂1.酶与一般催化剂的共同性质●用量少而催化效率高●不改变化学反应的平衡点●可降低反应的活化能2.酶作为生物催化剂特性●催化效率高●高度专一性●酶的活性受调节和控制●酶易失活二、酶的化学本质到目前为止，除了具有催化活性的RNA核酶之外，已经发现的大多数酶都是蛋白质。

蛋白质的一切性质酶也都具有。

具有催化作用的蛋白质是酶。

三、酶的化学组成和分类1.根据酶的化学组成成分可将酶分为以下两类：单纯酶蛋白：只含有蛋白质辍和酶蛋白：脱辅酶+辅因子=全酶（脱辅酶决定酶催化的专一性，辅因子起着电子、原子或化学基团的传递作用。

）2.根据酶分子的特点可分为以下三类：单体酶：由一条多肽链组成寡聚酶：由两个或两个以上的亚基组成多酶复合体：由几种酶嵌合形成复合体第二节酶的分类和命名一、国际系统分类及酶的编号酶分为六大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、连接酶类（合成酶）。

二、习惯命名命名原则：1.酶的底物2.催化的反应性质3.结合上述两个原则命名第三节酶的反应速度和活力单位一、酶的反应速度及酶活力酶的反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。

一定要用初速度来表示。

二、酶的活力测定及活力单位酶活力：又称酶活性。

即酶催化一定化学反应的能力。

通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度表示。

酶活力单位：一定条件下，在一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。

通常以每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示。

1.国际单位（IU）：最适条件下，每分钟催化1微摩尔底物转化为产物所需要的酶量。

即：1IU=1μmol/min2.习惯单位3.Kat单位（Katal）: 每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需要的酶量。

即：1Kat=1mol/s4.转换数：每微摩尔酶每秒钟转化底物的微摩尔数。

5.比活力：表示每毫克蛋白含有的酶活力单位数。

酶的比活力代表酶的纯度，比活力越大纯度越高。

酶工程复习题

酶工程复习题

酶工程复习题第一章绪论填空：1.日本称为“酵素”的东西，中文称为酶，英文则为Enzyme，是德国科学家Kűhne于1878年首先使用的。

2.1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得脲酶结晶，并指出酶的本质是蛋白质。

他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖。

3. 1982年，Thomas R.Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶—Ribozyme。

4. 1894年，高峰让吉（Takamin）用麸皮培养米曲霉制造淀粉酶作消化剂，开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。

5. 1969年，日本的千畑一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸分离L-氨基酸。

6.1971年，第一届国际酶工程会议把酶的生产与应用确认为酶工程的核心内容。

7.根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为蛋白类酶和核酸类酶。

名词解释：酶：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。

选择：1.酶工程是（C ）的技术过程A.利用酶的催化作用将底物转化为产物B.通过发酵生产和分离纯化获得所需酶C.酶的生产与应用D.酶在工业上大规模应用2.核酸类酶是（D ）A.催化RNA进行水解反应的一类酶B.催化RNA进行剪接反应的一类酶C.由RNA组成的一类酶D.分子中起催化作用的主要组分为RNA的一类酶第二章酶学基础填空：1.1961年国际酶学委员会（International Commission of Enzymes）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：氧化还原酶Oxidoreductase；转移酶Transferase；水解酶hydrolase；裂合酶Lyase；异构酶Isomerase；合成酶Synthetase。

2.酶催化作用的特点：温和性、专一性、高效性、可调性.3.根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分为两大类：不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

2 衔可 接设 物计 ，具 并不 可同 大限 量制 制酶 备识 。别 位 点 的
1 兼 具 同 聚 物 加 尾 和 黏 性 末 端 的 优 点

优 点
DNA接头（adapter）连接法
人工合成的一头具某种限制性内 切酶粘性末端，另一头为平末端 的特殊双链寡核苷酸短片段。 当它的平末端与平末端的外源DNA 片段连接之后，便是后者成为具 粘性末端的新的DNA分子。
与缺口转移制备DNA探针的方法相比， T4 DNA聚合酶催化的取代合成法制备探针 具有两个明显的优点：第一，不会出现缺
口转移法中可能产生的发夹结构；第二，
经适当的限制性核酸内切酶切割后可以很 容易地转变成链特异性探针。
应当注意的是，取代合成法不能够均匀标 记整条DNA链，也难以标记片段中部的核苷酸， 这一点与切口平移法完全不同。由于T4 DNA聚 合酶的3’外切酶活性并无序列特异性，在它 的作用下，所有DNA片段长度减少的速度都基 本相同；同时由于3’核酸外切酶的活性降解 单链DNA的速度比降解双链DNA的快得多，因此 当降解到中点时，一条限制片段将会分离成两 个半长的单链，随后迅速地被完全降解，所以 及时终止外切反应对于成功的末端标记是十分 重要的。
5 平末 端 DNA 片段 的连 接
T4DNA连接酶的连接 同聚物加尾法 衔接物连接法 DNA接头（adapter）连接法

同聚物加尾法
1原理
同 聚 物 加 尾 法
需要末端脱氧核苷酸转移酶， 能够将核苷酸加到DNA分子单链延 伸末端的3’－OH上，并不需要由 模板的存在，当反应物中只存在 一种脱氧核苷酸的条件下，便能 够构成由同一种类型的核苷酸组 成的尾巴。
T7 DNA聚合酶经过适当化学处理可以使其 失去3’→5’外切酶活性而转变为一种新的 DNA聚合酶一一修饰的T7 DNA聚合酶。修饰的 T7 DNA聚合酶由于失去了核酸外切酶活性，在 单链模板上的聚合作用的速率增加了3倍，在 物理特性、聚合酶性质以及连续合成能力等方 面，都同天然的T7 DNA聚合酶完全一样。修饰 的T7 DNA聚合酶是双脱氧终止法对长片段DNA 进行序列测定的理想用酶，并以测序酶作为商 品名广泛使用。此外，修饰的T7 DNA聚合酶也 可用于有效地填补和标记具有5’突出未端的 DNA片段之3’末端。
缺点
在重组工作中经常还需要从重 组分子上分离出克隆的DNA片段， 如果重组DNA是T4DNA连接酶或同聚 物加尾法构建的，就无法用原来的 限制酶作特异性的切割，因此就不 能够获得插入的DNA片段。后面两 种方法将克服这种缺陷。
衔接物（linker）连接法
1 用化学方法合成的一段由10－20 个核苷酸组成，具有一个或数个限 制识别位点的平末端的双链寡核苷 酸短片段。
+

温度 一般为4－15℃ 比较合适
O/N
6 影 响 因 素

ATP浓度1-10 umol/L

平 1-2U T4DNA连接酶 粘0.1U 插入片段/载体分子的摩尔比值

片段比载体应多
第三节 其它几种常用的工具酶
一
DNA聚合酶（DNA polymerase）
催化以DNA为模板合成DNA的反应，在DNA 重组技术中用于DNA的体外合成。经常使用的 DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）、 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（Klenow 酶）、T4DNA聚合酶、耐高温DNA聚合酶，末端 核苷酸转移酶以及反转录酶等。这些DNA聚合酶 的共同特点在于：它们都能够把脱氧核糖核苷 酸连续地加到双链DNA引物链的3’-羟基末端上， 催化核苷酸的聚合，形成新的DNA链。
T4 DNA聚合酶可以用来标记DNA平末端或 隐蔽的3’末端。但反应必须在高浓度的dNTP 存在下进行，以使5’→3’聚合反应压倒强 劲的3’→5’外切活性，出现DNA净合成反应， 从而补平缺口。
对于3’突出末端的DNA分子进行末端标 记，则分两步进行。首先利用3’→5’外 切活性切除3’端突出尾，从而产生3’凹 端，然后在高浓度的某一种放射性同位素 标记的dNTP存在下，外切降解反应与dNTP 搀入的合成反应达到平衡，进而在T4 DNA 聚合酶的聚合活性催化下，利用高浓度的 dNTP逐渐取代的原有的核苷酸，这种反应 称为取代合成。应用取代合成法可以给平 末端的DNA片段或具有3’隐蔽末端的DNA片 段作末端标记。
2、Klenow聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌 蛋白酶处理，可以产生大小不同的两个片段。 其中的大片段称为Klenow片段（由Klenow等人 于1970年报道），分子量为76 kD 。Klenow聚 合酶仍具有两种催化活性：①5’→3’聚合酶 活性，可以合成DNA；②3’→5’外切酶活性，可 从3’端降解DNA；但是它失去了5’→3’外切 酶活性。 在DNA克隆中，Klenow酶的主要用途有：通过聚 合作用填补或标记DNA的3’隐蔽末端，催化合 成cDNA的第二链；DNA序列测定。
4、T7 DNA聚合酶
T7 DNA聚合酶是从感染了T7噬菌体的大肠杆 菌寄主细胞中纯化出来的一种复合形式的核 酸酶，由两种不同的亚基组成：一种是T7噬 菌体基因5编码的蛋白质，其分子量为84kD；
另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白
（thioredoxin），其分子量为12kD。
T7 DNA聚合酶具有极高的连续合成能力（即高度
DNA聚合酶Ⅰ的主要用途是通过DNA缺口平移 的方法制备DNA探针，用于核酸杂交分析，如图 所示。图中，双链DNA的单链缺口在DNA聚合酶Ⅰ 的5’→3’外切活性作用下，从缺口的5’端逐 步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的3’ 游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向 下游移动，这种缺口移动的现象称为缺口平移。 如果反应中使用的单核苷酸底物是用同位素标记 过的，则合成产生的DNA分子即可作为带放射性 标记的DNA分子杂交探针。
续进性），可以连续合成数千个核苷酸，是目前 已知持续合成能力最强的DNA聚合酶，这种高续 进性得益于硫氧还蛋白的辅助作用，使得基因5 蛋白与模板的亲合能力增强。除聚合活性以外，
T7 DNA聚合酶还具有单链及双链的3’→5’核酸
外切酶活性（由T7噬菌体基因5所编码）。类似 于T4 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶的3’→5’核 酸外切酶活性也很强，约为Klenow酶的1000倍。 T7 DNA聚合酶没有5’→3’外切酶活性。
5'- G 3'- CTTAA
32P-dATP
5'- G A*A* 3'- CTTAA
Klenow
5'- GTGA
3'- CACT
32P-dATP
5'- G
3'- CACT
5'- G T*
3'- CACT
Klenow
3、T4 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大 肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚 合酶。它由噬菌体基因43编码，分子量为 114kD，同大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段 相似，具有两种酶催活性，即5’→3’的聚 合酶活性和3’→5’外切酶活性。而且 3’→5’外切活性对单链DNA的作用比对双链 DNA更强。
4 粘性 末端 DNA 片段 的连 接

常规方法
存在问题 碱性磷酸酯酶

常Leabharlann 方法具粘性末端的DNA片段的连接比较容易，用 两种连接酶都可完成此过程。
存在问题
由限制酶产生的具有粘性末端的载体 DNA分子，会自我环化作用。给筛选工 作带来麻烦，假阳性比率高。
1 碱性磷酸酯酶有两种
碱性 磷酸 酯酶
第二章 酶学基础
第二节连接酶

第二 节
连接 酶



1 概念 2 特性 3 分子机理 4 粘性末端的连接 ５平末端的连接 ６影响因素
1
连接酶：能够催化在两条DNA链
概 念
之间形成磷酸二酯键的酶
nick
gap
连接酶
有活性
连接酶
无活性
（a）
（b）
（a）具有3’－OH和5’－P基团的一个缺 口，失去磷酸二酯键，连接酶可封闭起来。 （b）缺失一个或数个核苷酸的裂口， 连接 酶不能将它封闭起来。
2 连接 1）先5’－末端磷酸化， 然 后用T4DNA连接酶将 linker与片段连接上
2）用限制酶切，产生互补 的粘性末端， T4DNA连接酶将片段 与载体连接。
3
如 点含果 缺 有待 点 与克 所隆 加的 的 衔 接片 物段 相或 同基 的因 限内 制部 位也 DNA

可 实 现 定 向 克 隆
2 程序 3 缺点
程序
1 在平末端的DNA分子上产生出带3’ －OH的单链延伸末端
2 连接反应 由核酸外切酶处理的DNA、 DNTP、末端脱氧核苷酸转移酶组成。
3 DNA分子的3’－OH将会出现单纯由 某一核苷酸组成的单链延伸的尾巴。 按同样道理给另一DNA分子加上互补 的尾巴 4 2个互补末端的DNA分子实现了连接
2
特 性
1）需要一条DNA链的3’－末端具有一个游 离的羟基（－OH），另一条5’－末端具有 一个磷酸基团（－P） 2）被连接的DNA链必须是双螺旋分子的一部 分，实际上连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上 的缺口（nick），而不是封闭裂口（gap） 3）提供能量
３）提供能量 在大肠杆菌及其细菌中，DNA连接酶催化 的连接反应，是利用NAD＋作能源的。 在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP作 能源。 这样连接酶有两种来源一种是由大肠杆菌 染色体编码的叫做DNA连接酶。另一种是由大 肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。 作用机理没有什么差别。
1、DNA聚合酶Ⅰ
到目前为止，已经从大肠杆菌中纯 化出三种不同类型的DNA聚合酶，即DNA聚 合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。在 大肠杆菌中，DNA聚合酶Ⅰ和聚合酶Ⅱ被 认为主要参与DNA的修复，而DNA聚合酶Ⅲ 功能则与DNA复制有关。在分子克隆操作 中主要使用的是DNA聚合酶Ⅰ。