微生物比浊法检定抗生素G418效价

中国抗生素杂志２００８年２月第３３卷第２期

文．编号：１００１－８６８９（２００８）０２－００９０－０３

微生物比浊法检定抗生素Ｇ－４１８效价’

杨天踢１．２彭宣宪２．０

（１厦门大学附属中山医院，厦门３６１００４；２厦门大学生命科学学院，厦门３６１００５）

摘要：采用微生物比浊法检定抗生素Ｇ４１８的效价。在本实验的浓度范围内（（３．　７６ｐ．ｇ／ｍｌ一８．　７７ｐｇ／ｍｌ），标准曲线线性方程为Ｙ二一。．　９１８４　Ｘ　＋　０．　９９１７，回归方程为Ｙ二一０．９２１５Ｘ＋０．９９２７，　ｒ二一１．０００２，其浓度与吸收度的线性关系良好，标准曲线成立。样品检测可靠性测验，回归显著（Ｐ＜０．　０５），　Ｓ，Ｔ为平行直线，实验结果可靠。采用微生物比浊法测定Ｇ４１８的效价，具有耗时短，灵敏度高，操作简便，不需要特殊设备，且人为影响因素少等诸多特点，值得推广应用。

关健词：Ｇ４１８；微生物比浊法；效价 中图分类号：Ｒ９７８．１＊２文献标识码：Ａ

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｃｙ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｇ－４１８　ｂｙ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ

Ｙａｎｇ　Ｔｉａｎ－ｃｉ＇．２ ａｎｄ Ｐｅｎｇ　Ｘｕａｎ－ｘｉａｎ２（１　Ｘｉａｍｅｎ　Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，　Ｘｉａｍｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｘｉａｍｅｎ　３６１００４；２　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｘｉａｍｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉａｍｅｎ　３６１００５）

ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ａ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｃｙ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｇ４１８．　Ｔｈｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ

ｃｕｒｖｅ　ｗａｓ　ｉｎｅａｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　３．７６Ｕ／ｍｌ一８．７７Ｕ／ｍｌ，　ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｉｓ　Ｙ二

一０．　９１８４Ｘ＋０．　９９１７　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｉｓ

ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ“ｗｅｌｌ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｓ　ｒｅｌｉａｂｌｅ Ｙ二一０．　９２１５　Ｘ＋０．９９２７

ｗｉｔｈ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｒ＝一１．０００２．　Ｔｈｅ　ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ

（Ｐ＜０．　０５）　ａｎｄ　Ｓ　ａｎｄ　Ｔ　ｐａｒａｌｌｅｌ　ｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｍｏｒｅ　ｗｉｄｅｌｙ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ，　ａｃ－

ｃｕｒａｃｙ　ａｎｄ　ｑｕｉｃｋｎｅｓｓ．ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ Ｇ－４１８； Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ； Ｐｏｔｅｎｃｙ

Ｇ４１８　（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）是一种结构与新霉素、庆大霉

素、卡那霉素相似的氨基糖昔类抗生素，在分子生物

学实验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂（１．２１。它

通过抑制转座子Ｔｎ６０１，Ｔｎ５的基因，干扰核糖体功能

而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素，

包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动

物和蠕虫。Ｎｅｏ基因被整合进真核细胞ＤＮＡ后能启动

Ｎｅｏ基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ，获得抗性产物氨

基糖昔磷酸转移酶的高效表达，将Ｇ－４１８转变成无毒

的形式，使细胞获得抗性而能在含有Ｇ－４１８的选择性

培养基中生长。Ｇ－４１８的这一选择特性，已在基因转

移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以

广泛应用‘，一‘１。鉴于各种细胞系对Ｇ－４１８的敏感性不一，而商业化制备的此抗生素的效价不同，因此，准确

简便的生物效价检定显得十分重要。目前，国内外药

典中均未见Ｇ－４１８收载‘７，９１。本文采用微生物比浊法‘，】

测定６－４１８的效价，并与管碟法及高效液相色谱法测

定的结果进行比较，得到满意的结果，现报告如下。

１材料

金葡菌［ＣＭＣＣ　（Ｂ）　２６００３１，Ｇ－４１８标准品（批号１５８０２９，效价７５５Ｒｇ／ｍｇ，购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；

Ｇ－４１８原料（批号２００６１０－２，效价７２１　Ｎ１　，ｇ／ｍｇ，厦门太

阳马生物工程有限公司提供）；Ｇ－４１８供试品（市售）。

仪器ＵＶ－２６５　ＦＷ紫外分光光度计旧本岛津）；

高效液相色谱仪ＬＣ－ＶＰ日本岛津）；电子天平（ＢＴ１２４Ｓ，德国Ｓａｒｔｏｒｉ　ｕ：公司）、振荡恒温培养箱等。

收稿日期：２００７－０５－１１甚金项目：科技部科技创新基金资助（０４Ｃ２６２１３５１０１５７），作者简介：杨天赐，男，生于１９６６年，副主任技师，在读博士研究生。。通讯作者．Ｅ－ｍａｉｌ：　ｗａｎｇｐｅｎｇ＠　：ｍｕ．　ｅｄｕ．　ｃｎ

万方数据微生物比浊法检定抗生素Ｇ－４１８效价杨天赐等．９！．

培养基与试剂营养琼脂培养基：蛋白陈ｌｏｇ，牛

肉浸出粉３ｇ，氯化钠５ｇ，琼脂粉２０ｇ，加水至１０００ｍ１

（除琼脂外，混合上述成分，调节ｐＨ值使比最终的ｐＨ

值略高０．２－０．４，加人琼脂，加热溶化后过滤，调节ｐＨ值是灭菌后为７．０一７．２，在１１５℃灭菌３０ｍｉｎ）。营

养肉汤培养基：蛋白陈１鲍，牛肉浸出粉３ｇ，氯化钠

５ｇ，加水至１０００ｍ１（制备方法同营养琼脂培养基，只是

少了琼脂成分）。磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．　０）：取磷酸氢二

钠９．　３９ｇ和磷酸二氢钾３．　５ｇ，加水使成ｌｏｏｏｍｌ，滤过，

在１１５℃灭菌３０ｍｉｎ。水为新鲜蒸馏水，灭菌后备用。

１２％甲醛溶液。 本实验所需培养基、水、缓冲液等溶液事先用４号

垂熔玻璃漏斗滤过；试管（质均，重量、容量相等）、移

液管等器具经１６０℃干烤２ｈ灭菌。

２方法

２．１工作溶液制备 标准品、供试品溶液配制精密称取Ｇ－４１８标准

品１６．　６ｍｇ，溶于５０ｍｌ无菌水中，配制成２５０．　６６ｗｇ／ｍｌ

的溶液，备用。同样精密称取Ｇ－４１８供试品１６．　６ｍｇ，溶

于５０ｍ１无菌水中，备用。 金葡菌悬液制备取金葡菌的营养琼脂斜面培养

物，接种于营养琼脂斜面上，３７℃培养２０ｈ，用灭菌生

理盐水约２０ｍｌ洗下菌苔，制成悬液。取３ｍｌ该菌悬液加１２％甲醛溶液７５闪，使甲醛的终浓度为０．３％、以

含０．３％甲醛的灭菌生理盐水为空白，于紫外分光光度计５８０ｎｍ处测定，其透光率为５．１０％，置冰箱中备

用。 含金葡菌的液体培养基悬液的制备临用前，取

上述菌悬液约ｌ　ｏｍｌ，加人到３００ｍｌ的营养肉汤培养基

中，混合，立刻使用。

２．２仪器性能检查 取葡萄球菌悬液在紫外分光光度计４２０和６００ｎｍ

处测定，其Ａ４２０／Ａｅｏｏ　＝　０．　１６６＜　０．　２１３，表明该仪器适合

用于细菌比浊法测定。

２．３标准曲线法

取上述Ｇ－４１８标准品溶液１．　５，　２．　０，　２．　５，　３．　０，

３．　５ｍｌ，分别置于ｌ００ｍｌ容量瓶中，用磷酸盐缓冲液分

别稀释至刻度，取上述稀释液１．　Ｏｍｌ分别加人含有金

葡菌悬液的培养基９．　Ｏｍｌ的试管，每一剂量采用３个

试管，立即摇匀，于（（３７１１）℃摇床培养４ｈ，取出，立即

放人冰水浴中，加人１２％甲醛溶液（１－３）０．５ｍｌ，终止

微生物生长，于紫外分光光度计５３０ｎｍ处测定吸光

度；同时另取２支试管各加人标准品稀释剂１．　Ｏｍｌ，再

分别加人含有金葡菌悬液的培养基９．　Ｏｍｌ，其中一支试管与上述各管同法操作作为细菌生长情况得阳性对

照，另一支试管立即加人甲醛溶液０．　５ｍｌ，混匀，作为

吸光度测定的空白液。结果取Ｇ－４１８标准品溶液２．５．．３．　Ｏｍｌ操作的结果其吸光度值在０．３一０．７之间，故设

计剂距比为１：　１．　２，标准品高剂量ｄｓｌ二０．　７１６２ｗｇ，低

剂量ｄｓ２　＝０．　５９６８ｗｇ，

３实验结果３．１标准曲线直线回归检验

求出各剂量点的吸收度平均值，以剂量一吸收度求出相应的标准曲线线性方程为：Ｙ二一０．　９１８４　Ｘ　＋

０．９９１７ 对该标准曲线进行线性回归检验，回归方程为：Ｙ二一０．　９２１５　Ｘ　＋　０．　９９２７，；二一１．０００２，结果表明

Ｇ－４１８在本实验的浓度范围内（（３．７６一８．　７７Ｗｇ／ｍｌ），其

浓度与吸收度的线性关系良好，标准曲线成立。３．２样品检测可靠性检验

分别取Ｇ－４１８标准品溶液２．　５，３．　Ｏｍｌ，　Ｇ－４１８原料

样品溶液２．　５，３．　Ｏｍｌ，分别置１００ｍｌ容量瓶中，用磷酸

盐缓冲液稀释至刻度，再取稀释液１．　Ｏｍｌ分别加人含

９．　Ｏｍｌ培养基菌悬液的试管中，按正交拉丁方排列（每

一剂量用４支管，共１６支管），于（３７士１）℃摇床水浴

保温４ｈ，取出，立即放人冰水浴中，并于每管中加人

１２％的甲醛溶液（１－＋４）０．　５ｍ１，终止微生物生长，以同

条件下培养的９．　Ｏｍｌ培养基菌悬液加１２％甲醛溶液０．　５ｍ１、水１．　Ｏｍｌ为空白，于紫外分光光度计５３０ｎｍ处

测定其吸光度，以同时制备的标准曲线计算其测定值，

并计算回收率。结果表明，三种方法测定Ｇ－４１８效价的结果基本一致（表１）。按《中国药典》２００５年版（三部）

中生物检定统计法（附录ＸＮ）中（２．２）和（３．３）法进行

可靠性测验，结论是回归显著（Ｐ＜０．０５），　Ｓ，　Ｔ为平行

直线，实验结果可靠。 三方法间经扩检验，无显著性差异（Ｐ＞０．　０５）．

３．３供试品效价的计算

同３．２样品检测可靠性检验的操作，用供试品代

替样品，测定５批Ｇ－４１８供试品吸收度值，根据标准曲

线方程进行效价计算。将结果与管碟法及液相色谱法

进行比较，结果表明三种方法测定的效价结果基本一

致，浊度法和液相色谱法的可信限率比较低，误差小

（表２）０

４结论 目前，国内外药典中均未见Ｇ４１８收载。高效液相色谱法测定目前国内、外生产厂家检测Ｇ－４１８效价的

主要方法，但需要特定的仪器设备，而且成本高。微生

物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价检定方

万方数据