抗生素微生物检定管碟法

4．放置钢管 用钢管放置器，将干热灭菌的镊子或适宜方法将钢 管装于玻璃管中，放于钢管放置器上，将双碟打开，放入双碟台上， 托起双碟台，使钢管平稳落在培养基上，注意使各个钢管下落的高 度基本一致，钢管放妥后，双碟静置 5 ～10 min, 使钢管在琼脂内稍 下稳定后，再开始加抗生素溶液。 5．滴加抗生素溶液 每批供试品取6~10个双碟，滴加溶液可调式 移液器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。滴加溶液的顺 序:SH→TH→SL→TL。滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不 可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。
• 结果判断 • 1. 可靠性测验结果认为可靠，方可进行效价和可信限率计算。 • 2.可信限率 考核实验的精密度，除药典各论另有规定外，本法的 可信限率不得超过5%。上述各项规定都能符合者，试验结果成立。 • 3. 实验计算 所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的 110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。 • 4. 效价测定 一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符合规 定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。
• 结果的可靠性检验及效价测定： 抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结 果。
记录与计算 1. 试验记录 应包括抗生素的品种、剂型、标示量、 生产厂、批号、检查目的、检验依据、检验日期、温 度、湿度，标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对 人，抑菌圈测量结果。当用游标卡尺测量抑菌圈直径 时，应将测试数据以框图方式顺双碟数记录。当用测 量仪测量面积或直径时，应将电脑测试、计算、统计 分析的打印纸贴附于记录中。 2. 计算注意事项：a、浓度比不等于1.000时，如标准 品溶液（S）d的浓度为1005u/ml,而供试品溶液(T)的 浓度995u/ml，D=S/T=1.0101；也可将D值设为1.000， 而估计效价设为101.01% b、所测定的实际效价应在D值与估计效价乘积的90%和 110%范围内，超出就应重新估计效价。如估计效价为 100%，D=1.000，而测得的效价为115%，按110%重估效 价再进行试验。 C、原料及不合格供试品，进行平行试验，配置两份标准 品和两份供试品，一份标准品与一份供试品为一组滴 样

实验2 管碟法测定土霉素生物效价一、目的要求1、了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。

2、学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。

二、基本原理衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。

抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。

抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。

此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。

因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。

生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。

管碟法是扩散法的一种。

本实验采用管碟法测定抗生素的效价。

管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。

抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。

抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。

因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。

将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。

三、实验材料1、培养基（供摊布平板用）蛋白胨6g 酵母膏6g 牛肉膏1.5g 葡萄糖1g 琼脂15—18g蒸馏水1000ml pH:6.8 1.05kg/cm?/SPAN> 121.3?/SPAN>C灭菌20分钟2、菌种：黄色八叠球菌（Sarcina flava）3、土霉素碱标准品4、仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（5 00ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、温度计、牛津杯、镊子、培养盘、恒温箱、台秤等管碟法测定抗生素效价一、目的和要求1、了解管碟法的原理。

管碟法测定抗生素效价一、目的和要求1、了解管碟法的原理。

2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。

二、原理抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。

管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。

因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。

根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。

三、实验材料1、四环素类抗生素的标准品和样品。

2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。

3、培养基：250ml三角瓶分装150ml LB琼脂，150ml三角瓶分装50ml LB琼脂，50ml 三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。

4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。

5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。

四、实验实施1、配制标准品溶液2、配制样品溶液3、制备菌悬液。

4、制备平板：（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。

（2）另取冷却至50℃左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。

5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。

6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。

7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。

抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。

各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。

管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。

管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。

2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。

3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。

4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。

5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。

6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。

7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。

抗生素的生物效价测定法(管碟法)work Information Technology Company.2020YEAR抗生素的生物效价测定法测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。

生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。

抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。

稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。

这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。

所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。

由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。

比浊法原理及操作大致与稀释法相同。

比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。

这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。

这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。

扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。

经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。

抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。

各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。

管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。

管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。

2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。

3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。

4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。

5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。

6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。

7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。

管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。

但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。

根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。

1. 实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。

可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。

小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。

如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。

1.2 实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。

由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。

因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。

160℃干热灭菌2h后备用。

2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基2.1 样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。

供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。

称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。

标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。

天平中的干燥剂应保持经常注意更换。

称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。

稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。

用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。

抗生素微生物检定法1 简述生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。

后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。

《中国药典》也采用这两种方法。

抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基内，混匀后，经培养，测量培养基的浊度。

此法系根据抗生素在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度（浊度与细菌数量、细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系）之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准晶与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。

抗生素效价以“单位（U）”或“微克（μg）”表示。

抗生素管碟测定法2 仪器与用具2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。

半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100~10000级）及空调设备，控制室温在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。

操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。

注意操作，避免室内抗生素污染。

2.2 双碟内径约90mm，高16~17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。

碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸，碟内加水2~3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。

用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后，置清洗液中浸泡过夜，冲洗，沥干，置150~160℃干热灭菌2h或高压121℃蒸气灭菌30min，备用。

管碟法抗生素效价测量实验抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。

管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。

因此，当抗生素浓度达到或高于mic（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。

根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。

实验简介在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下:管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。

但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。

根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。

实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。

可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。

小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。

如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。

1.2 实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。

由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素(庆大霉素、争光霉素、链霉素等)或者被清洗用的杀菌剂(如新洁而灭、洗洁精、去污粉等)污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。

因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。

160℃干热灭菌2h后备用。

配制试验所需的样品及药品2.1 样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。

抗生素微生物检定法work Information Technology Company.2020YEAR抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。

测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。

除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。

管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。

该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。

（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。

（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。

2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。

新购的双碟应按上述要求进行检查。

检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。

（2）陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。

（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。

（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。

（5）游标卡尺：精密度0.02mm。

（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。

◇药品检验◇浅谈抗生素微生物检定———管碟法操作注意要点任董春(安徽金蟾生化股份有限公司中心化验室,淮北　235000) 抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定实验菌的固体培养基内呈球面形扩散,形成含一定浓度抗生素球形区,抑制了实验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

根据抗生素在一定浓度范围内,对数剂量与抑菌圈直径(面积)呈线性关系,比较标准品与供试品两者对接种的实验菌产生抑菌圈的大小,计算出供试品的效价。

本文根据实践工作经验,对抗生素效价检定操作过程中应注意的要点作一总结简述。

1　称量1.1　标准品与供试品的称量最好一次称取,不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内,标准品称量不可少于20mg ,一般为50mg 以下。

取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好,以免吸水。

1.2　吸湿性较强的样品,在称量前1～2h ,更换天平内干燥剂。

1.3　称量样品的容器重量最大不超过10g 。

称量标准品与供试品应用同一天平及砝码。

称量前被称的样品应放在干燥器内至少30min ,从冰箱取出的样品必须先在室温放置,使其温度与室温平衡后,才可称量。

2　稀释2.1　粉末状或结晶的供试品,第一步稀释应用容量瓶以消除体积上的误差。

稀释至5×102～1×103U ・L -1的溶液,以后的逐步稀释,也要用容量瓶稀释,并不超过3步。

2.2　每次吸取溶液用密刻度玻璃吸管,量取溶液前要用被量液流洗吸管2～3次。

吸取溶液后,用滤纸将外壁多余液体擦去,然后再从起始刻度开始放溶液。

注意放溶液时,吸管不要倾斜。

2.3　稀释供试品与标准品用的缓冲液,应用同一瓶内的缓冲液,以免因p H 或浓度不同而影响抑菌圈的生长与圆整。

2.4　与标准品所用的溶剂量及溶解时间等应尽量一致。

稀释时每次加液至容量瓶近刻度前,稍放置片刻,待瓶壁的液体完全流下,再准确补加至刻度。

2.5　用于稀释的刻度吸管和容量瓶,必须经过标定。

3　双碟的制备3.1　用水平仪检查效价测定操作台面是否水平,设法调整使其达到水平。

抗生素微生物检定学习报告及总结抗生素微生物检定法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。

测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。

除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。

管碟法（二剂量）测定抗生素的效价管碟法（cylinder plate method）是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。

管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管,管内放入标准品和检品的溶液，经16～18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。

抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。

1 实验材料1.1 实验试剂抗生素检定培养基Ⅱ号、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、0.9%灭菌生理盐水1.2 实验菌株及样品菌株为藤黄微球菌菌悬液，样品为车间生产的酒石酸泰乐菌素干粉。

1.3 实验仪器及设备玻璃烧杯、容量瓶、直径90mm的玻璃培养皿、刻度吸管、移液管、胶头吸管、不锈钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm）、镊子、菌株培养茄瓶、三角烧瓶、温度计、多功能微生物自动测量分析仪、微波炉、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、2 实验方法2.1 实验用菌株制备提前将藤黄微球菌接种于茄瓶斜面培养基，置30℃左右温箱培养2～3天后取出放4℃储存。

用时取出茄瓶于无菌环境下无菌操作，向茄瓶内加入5ml 0.9%灭菌生理盐水，轻轻摇动茄瓶，将斜面细菌洗下制备成一定浓度的菌悬液（浓度大小以最终产生的抑菌圈大小在16～18mm之间而定）。

2.2 抗生素检定培养基的配制准确称取抗生素检定培养基Ⅱ号26.5g倒入三角烧瓶中，加入1000ml纯化水，混匀后塞上塞子，以牛皮纸包扎后于115℃高压蒸汽灭菌30分钟备用。

缺点：(1)实验过程中需要严格的无菌操作环境，对 实验条件要求较高；(2)不同批次、不同来源的敏感 菌可能对实验结果产生一定影响；(3)对于某些具有 特殊作用机制的抗生素，可能需要采用其他方法进 行效价测定
管碟法测定抗生素
总结与展望
管碟法是一种经典的抗生素效价测定方法，具有操作简 便、直观等优点，广泛应用于药物研发、生产和质量控 制等领域。然而，随着科学技术的不断进步和新药的不 断涌现，管碟法也面临着一些挑战和改进的空间。未来 ，可以通过改进实验条件、优化操作流程和提高数据分 析能力等方式，进一步提高管碟法的准确性和可靠性， 为抗生素的研究和应用提供更加准确可靠的依据
操作规范：实验过程中应严格遵守无菌操作规范， 避免杂菌污染干扰 数据分析：在数据分析过程中，应采用适当的统计 方法对实验数据进行处理和分析，以获得准确可靠 的实验结果
管碟法测定抗生素
管碟法测定抗生素的优缺点
优点：(1)操作简便、直观，可快速获得实验结果； (2)适用于多种抗生素的效价测定，具有较好的通用 性；(3)可同时比较不同抗生素的ຫໍສະໝຸດ 菌效果，方便进 行药物筛选和质量控制
-
管碟法测定抗生素
A
管碟法是一种常用的抗生素效价测
定方法，其原理是将抗生素溶液置
于含有敏感菌的培养基中，通过测
定抗生素的抑菌圈大小来确定其效
价
B
下面将对管碟法测定抗生素的步骤 、注意事项和优缺点进行详细介绍
管碟法测定抗生素
管碟法测定抗生素的步骤
培养基制备：将基础培养基加热溶解，灭菌后冷却至50℃左右，加入适量敏感菌悬液 ，摇匀后倒入无菌培养皿中，待凝固后备用 抗生素溶液制备：将待测抗生素溶解于适宜溶剂中，制备成不同浓度的溶液 放置管碟：在培养皿上放置无菌管碟，轻轻按压使管底与培养基紧密接触 滴加抗生素溶液：用微量移液器将不同浓度的抗生素溶液滴加到管碟上，每个浓度至 少做3个平行试验 培养：将培养皿放入恒温培养箱中培养一定时间(一般为16-24小时)，使敏感菌在培养 基上生长

管碟法的操作步骤
预试验→试验准备→ 双碟底层的制备→
供试品、标准品溶液的制备→菌层的制备
→滴加抗生素溶液→双碟的培养→ 抑菌圈
的测量→结果的可靠性检验及效价测定
• 预试验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、 使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所 致的抑菌圈直径在18～22mm。高剂量与 低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的 抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。
• 试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭 菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、 缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
• 供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供 试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供 试品、标准品相关剂量的溶液。
1. 称量 称量前，将标准品从冰箱取出，使与温室平衡； 供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品 应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前1～2 ｈ更换 天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取， 不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量 不可少于 20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸 水。样品的称样量最好不少于50mg。
一、试验前准备
• 双碟的挑选
内径约90mm，硬质玻璃或 塑料培养平皿，水平透明， 无色斑气泡
• 物品的清洗、灭菌
培养皿、钢管、刻度吸管清 洗后160℃干热灭菌2小时或 121℃高压蒸汽灭菌30min， 放置室温备用；陶瓷瓦盖要 定期清洗干燥。
牛津杯的挑选
内径（6.0±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm，外径 （7.8±0.1）菌的来源：检定菌种由中监所所提 供的冷冻干燥品。 检定菌的传代和接种： 芽胞杆菌3～6个月（其他细菌每个月） 用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物 代替原有的菌种，作为工作用（阳性对照）菌 种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要 求进行。

管碟法测定生物效价
衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。

抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。

抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。

此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。

因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。

生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。

管碟法是扩散法的一种。

本实验采用管碟法测定抗生素的效价。

管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。

抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。

抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。

因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。

将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。

抗生素微生物检定法一、目的：阐述抗生素微生物的检定法。

二、适用范围：适用于抗生素微生物检定法。

三、责任者：品控部。

四、正文：1 简述抗生素微生物检定法，依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。

后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。

中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。

抗生素管碟检定法是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈线性关系，通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

抗生素效价以“单位（u）”或“微克（ug）”表示。

2 仪器与用具2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开；一部分为一般操作间，一部分为半无菌操作间。

半无菌操作间，设有紫外线灯达到空气消毒。

应装有空调设备，控制室温在20-25℃。

操作台可用稳固的水泥台，台面用玻璃板垫平，用水平仪校准，保持水平。

室内注意抗生素的污染。

2.2 双碟为硬质玻璃或塑料培养平皿，内径约90mm,高16-17mm,碟底厚薄均匀水平,无气泡.碟底平度检查,可将双碟放在水平台上,下垫一张白纸,碟内加2-3ml,再滴加蓝墨水,观察蓝色深汪是否一致.用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后,置玻璃仪器专用洗液或其他清洗液中浸泡过夜,冲洗,沥干,置150-160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。

2.3 陶瓦盖内径约为103mm，外径108 mm，平坦，吸水性强，应定期干燥、清洗。

2.4 钢管内径（6.0±0.1）mm,高(10.0±0.1) mm，外径（8.0±0.1）或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。

每次使用后应置1：1000新洁尔灭溶液内，浸泡2小时以上，进行灭菌后再行洗涤，先用水洗涤，超声波超声30分钟或用沾有去污粉的纱布条擦内外壁，用水冲洗，淋干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的溶器内，在150-160℃干热灭菌2小时备用。

抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。

测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的11 0%时，应调整其估计效价，重新试验。

除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。

第一法：管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液：取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。

用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液：取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液：取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。

临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液：取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

大肠埃希菌（Escherichia coli）悬液：取大肠埃菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。

临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。

啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液：取啤酒酵母菌（ATCC 9763）的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。