抗生素微生物检验

抗生素敏感试验操作流程及评分标准一、引言抗生素敏感试验是临床微生物学中的一项重要实验，用于检测细菌对不同抗生素的敏感性，从而为临床合理使用抗生素提供参考依据。

本文将介绍抗生素敏感试验的操作流程及评分标准。

二、操作流程1. 准备工作在进行抗生素敏感试验之前，需要准备以下材料和设备：- 特定培养基：选择适合目标细菌生长的培养基，如Mueller-Hinton 琼脂糖培养基。

- 抗生素纸片：选择常见的抗生素纸片，如青霉素、红霉素、氨苄西林等。

- 灼菌环：用于均匀涂布细菌悬液。

- 可调离心机：用于快速离心培养物。

2. 实验步骤步骤一：制备细菌悬液- 从培养基上挑取单一菌落，用无菌试管中的生理盐水或培养基悬浮液悬浮。

- 调整细菌悬液的浓度至0.5麦克法布（McFarland）浑浊度标准。

步骤二：涂布培养基- 取一块新鲜琼脂糖培养基平板，使用灼菌环均匀涂布细菌悬液在培养基上，旋转均匀。

步骤三：贴药品纸片- 使用无菌镊子，将不同抗生素纸片分别贴在培养基上，留出适当距离。

步骤四：离心培养基- 将培养基离心2分钟，使纸片与培养基充分接触。

步骤五：培养- 将培养基倒置孔朝下，置于恒温培养箱中，进行培养。

步骤六：观察结果- 在培养基上观察并记录菌落生长情况，观察抗生素纸片所贴区域的菌落是否生长或抑制。

三、评分标准根据抗生素敏感试验结果，可采用以下评分标准进行分析：- 敏感（S）：菌落生长完全受抑制；- 中度敏感（I）：菌落生长部分受抑制；- 抵抗（R）：菌落生长正常，未受抑制。

根据不同抗生素和细菌的敏感性和抵抗性程度，结合实际临床经验，可将评分标准进一步细分。

例如：- 高度敏感（HS）：菌落生长受抑制程度非常明显；- 低度敏感（LS）：菌落生长受抑制程度较轻；- 部分敏感（PS）：部分菌落生长被抑制，部分菌落生长正常；- 部分抵抗（PR）：部分菌落生长正常，部分菌落生长未受抑制。

根据评分标准，可以对细菌对不同抗生素的敏感性进行定量评估，并为临床治疗方案的选择提供参考。

发布日20070423期栏目化药药物评价>>化药质量控制标题抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析作者审评三部部门正文容审评三部审评五室英摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与围中溶液浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。

关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。

自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。

虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性；②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期化学分析法不可能完全取代微生物检定法。

中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。

一、方法的建立1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。

2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择可参照中国药典建立，在此不再赘述。

3、检定方法的确定可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。

一般确定线性与围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。

4、抗生素溶液的稳定性选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条件。

抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。

各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。

管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。

管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。

2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。

3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。

4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。

5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。

6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。

7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。

8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。

抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。

测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。

除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。

管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。

该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。

（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室。

（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。

2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。

新购的双碟应按上述要求进行检查。

检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。

（2）瓦圆盖：应平，无凹凸现象。

（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。

（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。

（5）游标卡尺：精密度0.02mm。

（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。

3. 试验材料（1）培养基及其制备方法以下培养基、缓冲液制备时，均以115℃灭菌30分钟。

培养基Ⅰ胨 5g 磷酸氢二钾 3g 水 1000ml牛肉浸出粉 3g 琼脂 15~20g除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过（用纸浆减压滤过或纱布棉花滤过），调节PH值使灭菌后为7.8~8.0或6.5~6.6，分装，灭菌。

实验室微生物ast
实验室微生物AST（抗生素敏感性测试）是一种用于确定微生
物对抗生素的敏感性或抗性的测试方法。

这种测试对于选择治疗方
案和监测抗生素耐药性非常重要。

AST通常通过以下步骤进行：
1. 样本收集，从患者身上收集微生物样本，例如血液、尿液、
痰液或其他体液。

2. 培养，将微生物样本在适当的培养基上培养，以促进其生长。

3. 鉴定，鉴定培养出的微生物种类，通常通过形态学特征和生
化试验。

4. AST测试，将已鉴定的微生物接种到含有不同抗生素的琼脂
板上，观察微生物在不同抗生素条件下的生长情况。

5. 结果解读，根据微生物在不同抗生素条件下的生长情况，确
定微生物对各种抗生素的敏感性或抗性。

AST测试可以帮助医生选择最有效的抗生素治疗方案，避免使
用对微生物无效的抗生素，减少抗生素滥用和耐药性的发展。

然而，AST测试也有局限性，例如需要时间和专业技能，有时会出现假阳
性或假阴性结果等问题。

因此，在临床实践中，医生通常会结合患
者的临床症状、病史和其他检查结果来综合判断最佳的治疗方案。

AST测试在微生物学和临床医学中扮演着重要的角色，对于治疗感
染病症具有重要意义。

实验报告微生物对抗生素的敏感性测试实验报告实验目的：本实验旨在通过微生物对抗生素的敏感性测试，了解微生物对不同抗生素的敏感度以及寻找合适的抗生素用于治疗感染性疾病。

实验原理：抗生素是一种能够抑制或杀死微生物的药物。

在临床上，常用的抗生素有青霉素、头孢菌素、红霉素等。

然而，不同种类的微生物对不同抗生素的敏感性有所不同。

通过进行微生物对抗生素的敏感性测试，可以确定哪种抗生素对某些微生物具有良好的杀菌作用。

实验步骤：1. 准备工作：清洗实验器材并消毒，准备好所需培养基和抗生素。

2. 预备培养基：根据实验要求，制备适当浓度的培养基。

将培养基倒入培养皿中，等待其凝固。

3. 培养微生物：选择需要测试的微生物菌株，在实验室条件下进行培养。

将微生物菌株接种至含有培养基的试管或琼脂平板上。

4. 抗生素敏感性测试：使用消毒针将不同抗生素溶液分别滴在培养皿上，确保每个培养皿中的抗生素浓度相同。

5. 培养：将培养皿放入恒温培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养。

6. 观察结果：观察培养皿中微生物的生长情况，并记录下来。

7. 分析结果：根据微生物的生长情况和抗生素的作用，判断微生物对抗生素的敏感性。

实验结果：根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 对某种抗生素敏感的微生物，在接触抗生素后，抗生素会抑制其生长，形成抗生素有效区域。

2. 对某种抗生素抗性的微生物，在接触抗生素后，仍然能够正常生长，没有形成抗生素有效区域。

3. 通过对不同微生物菌株的抗生素敏感性测试，可以找到适合治疗的抗生素。

实验讨论：本实验是一种常用的微生物实验方法，通过测试微生物对抗生素的敏感性，可以帮助医生选择合适的抗生素用于治疗感染性疾病。

然而，现今临床上微生物的抗药性问题十分严重，这意味着某些微生物已经对常规抗生素产生了抗性，因此需要开发新的抗生素或采用其他治疗方法。

实验结论：通过微生物对抗生素的敏感性测试，可以准确判断微生物对不同抗生素的敏感性。

实验结果对选择合适的抗生素进行治疗具有指导意义，在临床实践中有着重要的应用价值。

德信诚培训网更多免费资料下载请进： 好好学习社区抗生素微生物检定法一、目 的：阐述抗生素微生物的检定法。

二、适用范围：适用于抗生素微生物检定法。

三、责 任 者：品控部。

四、正 文：1 简述抗生素微生物检定法，依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。

后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。

中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。

抗生素管碟检定法是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈线性关系，通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

抗生素效价以“单位（u ）”或“微克（ug ）”表示。

2 仪器与用具2.1 操作室 光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开；一部分为一般操作间，一部分为半无菌操作间。

半无菌操作间，设有紫外线灯达到空气消毒。

应装有空调设备，控制室温在20-25℃。

操作台可用稳固的水泥台，台面用玻璃板垫平，用水平仪校准，保持水平。

室内注意抗生素的污染。

2.2 双碟 为硬质玻璃或塑料培养平皿，内径约90mm,高16-17mm,碟底厚薄均匀水平,无气泡.碟底平度检查,可将双碟放在水平台上,下垫一张白纸,碟内加2-3ml,再滴加蓝墨水,观察蓝色深汪是否一致.用过的双碟经高压灭菌倒出培养基后,置玻璃仪器专用洗液或其他清洗液中浸泡过夜,冲洗,沥干,置150-160℃干热灭菌2小时或高压121℃蒸气灭菌30分钟，备用。

2.3 陶瓦盖 内径约为103mm ，外径108 mm ，平坦，吸水性强，应定期干燥、清洗。

2.4 钢管 内径（6.0±0.1）mm,高(10.0±0.1) mm ，外径（8.0±0.1）或（7.8±0.1）mm ，每套钢管重量差异不超过±0.05g ，内外壁及两端面光洁平坦，管壁厚薄一致。

现代畜牧兽医2019年第2期抗生素微生物检定法——浊度法方法验证浅析张明（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳110016）摘要：总结本实验室在抗生素微生物检定——浊度法方法验证过程中取得的相关经验，以期对各兽药检测机构在进行抗生素浊度法的方法验证中提供参考。

按照2015年版《中国兽药典》附录1201第二法进行浊度法的方法学验证，并使用管碟法（第一法）与浊度法进行方法的比较测定。

结果显示，管碟法与浊度法对同一样品测定的结果无明显差异，相对偏差为0.4%～0.8%；抗生素浓度在3.0～7.0U/mL 时，A 与抗生素浓度对数呈良好的线性关系；对同一样品测量的浊度法重复性RSD 为0.8%，管碟法RSD 为2.2%，证明浊度法的重复性优于管碟法，且易于获得较好的可信限率，证明其测定结果的可靠性；不同人员使用浊度法对同一样品进行测定，结果分别为102.1%和98.9%，相对偏差为1.6%。

表明浊度法作为抗生素微生物检定法之一，与管碟法相比，耗时短、操作简便、灵敏度高，大大提高了检测效率。

本文总结的浊度法方法验证经验可为检测机构开展该项工作提供参考。

关键词：抗生素；效价；浊度法；方法验证中图分类号：O658文献标识码：B文章编号：1672-9692(2019)02-0012-04Analysis of the Verification on Antibiotic Microbial AssayMethod by Turbidimetric MethodZhang Ming(Liaoning Testing &Inspection Center for Quality &Safety of Veterinary Drugs,Feed and Livestock Products,LiaoningShenyang110016)Abstract:Summarize the relevant experience gained by the processofverification on antibiotic microbial assay method by turbidimetric method in our laboratory,in order to provide reference for the verification of the antibiotic microbial assay method by turbidimetric method for each veterinary drugs testing institution.The methodological verification of turbidimetric method was performed according to the second method of Appendix 1201of the Chinese Veterinary Pharmacopoeia 2015,the method of tube dish method(first method)and turbidimetric method was used for compari‐son and determination.The results showed that there was no significant difference between the tube dish method and the turbidimetric method for the same sample.The relative deviation was 0.4%～0.8%.When the concentration of antibiotic was 3.0～7.0U/mL,A had a good linear relationship with the logarithm of antibiotic concentration.The turbidimetric method has a repeatability RSD of 0.8%for the same sample and 2.2%for the tube dish method,which proves that the repeatabili‐ty of the turbidimetric method is better than the tube dish method,and it is easy to obtain a good fiducial limit rate,which proves the reliability of the results,different people used the turbidimetric method to determine the same sample,the results were 102.1%and 98.9%,respective‐ly,and the relative deviation was 1.6%.As one of the antibiotic microbial assays,the turbidi‐metric method is shorter in time,easier to operate,and more sensitive than the tube-disc meth‐收稿日期：2018-12-15作者简介：张明（1963-），男，本科，高级兽医师，主要从事兽药饲料畜产品残留检验检测工作。

抗生素微生物检定法来源：中国药典2000年版二部附录2006-12-10 00:30标题抗生素微生物检定法附录序号附录Ⅺ内容全文A. 抗生素微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。

培养基及其制备方法培养基Ｉ胨5g琼脂15～20g牛肉浸出粉3g水1000ml磷酸氢二钾3g除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。

培养基Ⅱ胨6g葡萄糖1g牛肉浸出粉 1.5g琼脂15～20g酵母浸出粉6g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6,在115℃灭菌30分钟。

培养基Ⅲ胨5g磷酸氢二钾 3.68g牛肉浸出粉 1.5g磷酸二氢钾 1.32g酵母浸出粉3g葡萄糖1g氯化钠 3.5g水1000ml除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。

培养基Ⅳ胨10g葡萄糖10g氯化钠10g琼脂20～30g枸橼酸钠10g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。

培养基Ⅴ胨10g琼脂15～20g麦芽糖40g水1000ml除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。

抗生素耐药性相关微生物的鉴定与控制抗生素耐药性是当今世界面临的重大挑战之一。

随着抗生素的广泛应用和滥用，越来越多的微生物菌株对常规抗生素产生了耐药性。

高度耐药的病原菌对人类健康构成了严重威胁，因此，准确鉴定并控制抗生素耐药性相关微生物至关重要。

一、抗生素耐药性相关微生物的鉴定方法1. 传统鉴定方法传统的微生物鉴定方法主要依靠菌落形态、生理生化特性和培养基特异性等特点进行判断。

然而，这种方法存在时间长、操作复杂、灵敏度低等缺点，对于某些耐药性微生物的鉴定效果较差。

2. 分子生物学方法分子生物学方法作为一种新兴的鉴定手段，已经在抗生素耐药性相关微生物的鉴定中得到广泛应用。

其中，PCR（聚合酶链反应）技术、荧光原位杂交（FISH）技术等被广泛用于检测耐药基因或特定微生物的存在。

二、抗生素耐药性相关微生物的控制策略1. 合理使用抗生素合理使用抗生素是控制抗生素耐药性的关键措施之一。

医务人员应遵循抗生素使用指南，严格控制抗生素的使用途径、剂量和疗程，防止不必要的滥用和误用。

2. 发展新型抗生素随着耐药性菌株的出现，传统抗生素在某些病原体上的治疗效果下降明显，因此，合理开发和使用新型抗生素是控制抗生素耐药性的重要手段。

科研人员应持续地投入到新型抗生素的研发中，以满足临床对抗生素的需求。

3. 加强病原菌的监测与诊断定期监测和诊断抗生素耐药性相关微生物的分布情况对于制定科学合理的防控策略至关重要。

建立完善的病原菌监测网络，加强实验室能力，对于耐药性病原菌进行准确鉴定和持续监控。

4. 提高人们的健康意识人们对于抗生素的错误认识和滥用意识普遍存在，因此，加强公众关于抗生素的相关知识宣传和教育十分重要。

提高人们的健康意识和科学合理使用抗生素，能够从根本上减少抗生素的滥用和抗生素耐药性的产生。

通过合理鉴定和控制抗生素耐药性相关微生物，可以有效预防和减少耐药性病原菌的传播和蔓延，保障人类的健康和生命安全。

因此，科学研究和实践应该在鉴定与控制抗生素耐药性方面持续深入，以期在保护公共卫生和人类健康方面取得更大的进展。