生物化学实验报告班级：学号：姓名：实验室：评分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━日期：实验一：血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测实验目的：1、熟悉盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法脱盐分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法进行纯度鉴定的原理和基本方法4、掌握分光光度计检测蛋白质含量的原理和基本方法实验原理：1.盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
此外，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
2.凝胶层析法脱盐：在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱;反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。
分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。
3.醋酸纤维素薄膜电泳：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
4.分光光度计是应用分光光度法（即比色法）测定物质含量的装置。
通常需要加入某种显色剂，以产生有色化合物，其颜色深浅与待测化学成分的含量成正比，据此对待测物浓度进行测定。
分光光度计的工作原理及分光光度法的计算根据Lambert-Beer定律导衍而得Abs（吸光度）=KCL K:摩尔吸收系数 C:吸光物质浓度 L-溶液厚度实验操作：1.硫酸铵分段盐析:血清2.0 ml,加入PBS2.0ml,一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵2.0 ml,混匀后室温下静置10分钟，3000rpm离心10分钟。
血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定综合性实验的创新与实践摘要】为改革生物化学实验，提高实验教学水平，对“血清γ-球蛋白的分离与提纯”实验进行改进和重新整合，建立了综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”，实现实验内容和生化技术的综合与创新。
经过4年的医学本科生教学实践，实验方法稳定，结果重复可靠，适合实验教学，有利于提高大学生的综合实验技能。
【关键词】γ-球蛋白综合性实验创新血清γ-球蛋白又称免疫球蛋白（Ig），具有重要的医药应用价值。
许多医学院校把提取血清γ-球蛋白作为生化实验教学内容。
本室于2007年初，对原有生化实验“血清γ-球蛋白的分离与提纯”进行了改进和大胆的创新，选用猪血清，保留原有的硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶除盐的操作步骤，增加了分光光度法测定蛋白含量、醋酸纤维素膜及SDS-PAGE法鉴定提取的血清γ-球蛋白纯度，建立并开设了16学时的综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”。
通过血清γ-球蛋白的分离、纯化、鉴定、蛋白测定及进一步鉴定的五个子实验，涵盖了生化的离心、层析、分光光度和电泳法四大传统技术。
突破了旧的单纯验证理论或简单孤立的学习一种实验方法或一个知识点的教学模式，使学生受到一次综合性生化技能训练，提高了实验教学效率和效果。
1 材料与方法1.1 仪器材料1.1.1 仪器 KDC-40低速离心机、1.5cm×20cm玻璃层析柱、722-可见分光光度计、DYY-2C电泳仪及DYCZ-24D型垂直板电泳槽。
1.1.2 试剂材料新鲜猪血清、pH7.0饱和硫酸铵溶液、0.01mol/L pH7.0 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）、葡聚糖凝胶G—25（SephadexG-25）、奈氏（Nessler）试剂、20%（W/V）磺基水杨酸溶液、pH8.6离子强度0.06巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、BSA（牛血清白蛋白）等，除SephadexG-25外均为国产。
实验血清γ—球蛋白的分离与纯化蛋白质是重要的生物大分子之一。
在生物材料常以混合物状态存在，因此掌握蛋白质的分离、纯化与鉴定的基本原理，掌握有关的技术操作 ( 本实验重点掌握柱层析技术 )，无疑对蛋白质化学及其生物学功能的研究是十分重要的。
常用于分离蛋白质的方法有盐析、柱层析。
超离心，超滤和电泳等等。
根据目的要求不同，可分别采用或几种方法配合使用。
本实验以分离血清中γ球蛋白为例，介绍蛋白质的分离、纯化与鉴定过程，其中包括盐析，离子交换、浓缩和电泳几个步骤。
盐析法——半饱和硫酸铵溶液沉淀γ-球蛋白[实验原理]不同的蛋白质，其生物学和理化学性质如分子大小、溶解度、等电点，吸附性质及其对其他分子(配基)的亲和力等都不相同。
利用这些差异，可分离提纯各种蛋白质。
血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白，α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。
其中γ-球蛋白含量约占16%，100m1血清中约为1.2g左右。
可利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐类溶液中(常用的有硫酸铵、硫酸钠)溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心而分离。
沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
凝胶层折法——去除γ-球蛋白的粗制品中的盐用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化。
因此必须占先去除。
常用的方法有透析法、凝胶层折法等。
本实验采用凝胶层折法，其原理是利用蛋白质与无机盐类之问分子量的差异。
当溶液通过Sephadex G-50凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中。
因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
阴离子交换层折法——DEAE纤维素纯化γ-球蛋白脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。
α-球蛋白，β-球蛋白的pI < 6.0；γ-球蛋白的pI为7.2左右。
