血清γ-球蛋白的盐析分离

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定一、实验目的1.掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；3.了解柱层析技术。

二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。

本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。

1．盐析蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。

盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵((NH４)２SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。

由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。

2．脱盐盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。

本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。

分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3.纯化（离子交换层析）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。

生物化学实验报告班级：学号：姓名：实验室：评分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━日期：实验一：血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测实验目的：1、熟悉盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法脱盐分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法进行纯度鉴定的原理和基本方法4、掌握分光光度计检测蛋白质含量的原理和基本方法实验原理：1.盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

此外，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。

2.凝胶层析法脱盐：在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱;反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。

分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3.醋酸纤维素薄膜电泳：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此可以将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

4.分光光度计是应用分光光度法（即比色法）测定物质含量的装置。

通常需要加入某种显色剂，以产生有色化合物，其颜色深浅与待测化学成分的含量成正比，据此对待测物浓度进行测定。

分光光度计的工作原理及分光光度法的计算根据Lambert-Beer定律导衍而得Abs（吸光度）=KCL K:摩尔吸收系数 C:吸光物质浓度 L-溶液厚度实验操作：1.硫酸铵分段盐析:血清2.0 ml,加入PBS2.0ml,一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵2.0 ml,混匀后室温下静置10分钟，3000rpm离心10分钟。

11.6⽣化实验报告⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验⽬的】1、了解蛋⽩质分离提纯的总体思路。

2、掌握盐析法、凝胶层析法和离⼦交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋⽩质的⽅法。

【实验原理】1、蛋⽩质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒⼦使蛋⽩质周围的⽔化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的⼀种。

向蛋⽩质溶液中加⼊某些浓的⽆机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋⽩质凝聚⽽从溶液中析出，这种作⽤就叫做盐析。

盐析不能使蛋⽩质变性，可以复原。

利⽤这个性质，可以采⽤多次盐析的⽅法来分离、提纯蛋⽩质。

蛋⽩质在⽔溶液中的溶解度取决于蛋⽩质分⼦表⾯离⼦周围的⽔分⼦数⽬，亦即主要是由蛋⽩质分⼦外周亲⽔基团与⽔形成⽔化膜的程度以及蛋⽩质分⼦带有电荷的情况决定的。

蛋⽩质溶液中加⼊中性盐后，由于中性盐与⽔分⼦的亲和⼒⼤于蛋⽩质，致使蛋⽩质分⼦周围的⽔化层减弱乃⾄消失。

同时，离⼦强度发⽣改变，蛋⽩质表⾯的电荷⼤量被中和，蛋⽩质溶解度更加降低，之蛋⽩质分⼦之间聚集⽽沉淀。

由于各种蛋⽩质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋⽩质不同，从⽽使之从其他蛋⽩中分离出来。

简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加⼊蛋⽩质溶液，使蛋⽩质表⾯电荷被中和以及⽔化膜被破坏，导致蛋⽩质在⽔溶液中的稳定性因素去除⽽沉淀。

由于清蛋⽩的亲⽔性⽐球蛋⽩⼤，且清蛋⽩的分⼦⽐球蛋⽩⼩，所以清蛋⽩需要⾼浓度的盐溶液才能够发⽣盐析，低浓度的时候球蛋⽩发⽣盐析。

盐析法分离蛋⽩质：各种蛋⽩质的颗粒⼤⼩、亲⽔程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不⼀样。

调节盐浓度可使不同的蛋⽩质沉淀，从⽽达到分离的⽬的。

常⽤中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。

硫酸铵：温度系数⼩，溶解度⼤，蛋⽩谱⼴，盐析效果好，不易引起变性。

可⽤硫酸/氨⽔按需要调节pH值。

本实验中清蛋⽩分⼦⼩，亲⽔性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，⽽球蛋⽩分⼦⼤，亲⽔性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。

血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。

2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。

3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。

【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。

根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。

1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。

在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。

（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。

脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。

在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。

葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。

不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。

把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。

比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。

这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。

大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。

所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。

（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。

用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。

血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化一、目的与要求1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。

2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。

3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案，技术路线，质量监控和保证措施。

二、实验原理血清蛋白有300多种，可粗略的分为清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。

欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下：C2H5H纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4H++H2PO4DEAE纤维素离子交换柱COOHC2H5α、β、γ球蛋白NH2COOH经过盐析和脱盐的球蛋白液纤维素-O-(CH2)2-N+…α和βGPH6.3NH2交换到柱上的α和β-球蛋白H2PO4COOHγ-球蛋白NH3+被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。

纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。

三、仪器和材料仪器：离心机，1.5×40cm层析柱，层析架或滴定台，核酸-蛋白检测仪，部分收集器，紫外分光光度计，色谱柱，电泳槽，电泳仪。

材料：马血清，SephadexG-25×200g，DEAE-32×200g。

四、实验步骤（一）分离纯化步骤1、取3mL,4℃预冷血清，加入3mL4℃预冷的饱和硫酸铵。

边滴边摇。

2、静置大于10min后，3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀溶于少量的生理盐水。

从中取0.5mL用于测定蛋白质含量。

3、将剩余的样品上SephadexG-25柱，用0.02mol/LpH6.5的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集3mL，用于绘制洗脱曲线，选择颜色最深（即浓度最高管）的取0.5mL留待电泳用。