分离提纯鉴定血清清蛋白

血清清蛋白的分离、纯化与鉴定2010级检本5班宋立群陈然焦志会张翼鹏王旭东【目的要求】1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2．了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理。

3. 掌握电泳的基本原理；4.掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。

5．熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和应用。

6．熟悉紫外分光光度计的使用。

【实验原理】血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-β-γ-球蛋白等），由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。

本实验应用不同浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。

在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。

用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。

本实验采用凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差异除去粗制品中盐类。

脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE（二乙氨乙基）纤维素层析柱进一步纯化。

DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的清蛋白、α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出。

提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。

将醋酸铵溶液的浓度提高至0.3mol/L，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。

经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。

为便于鉴定，常需浓缩。

浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。

蛋白质是两性电解质，在同一pH环境下，混合蛋白质中各种成分带电量不同、分子大小不同，在同一电场中泳动的速度不同，导致相同的时间迁移的距离不同而把它们分开。

血清中含有多种蛋白质，用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，γ-球蛋白的等电点为7.3，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，因此在电场中比其它蛋白质移动速度慢。

而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于7.3（pl分别为4.9、5.06和5.12），因此在电场中比γ-球蛋白移动速度快。

血清清蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm 波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。

由于核酸在280nm 波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260 nm处。

如同时测定260nm 的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。

因此如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm 及260nm 的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。

【试剂与器材】1.试剂.（1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。

（2）0.3mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：称取醋酸铵23.12g,加蒸馏水800mL，用稀氨水或稀醋酸调pH至6.5，定容至1000mL。

(不得加热)（3）0.06mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释5倍。

（4）0.02mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释3倍。

（上述3种缓冲液要确保浓度和pH的准确性，稀释后要重调pH）（5）300g/L三氯乙酸（6）纳氏试剂（7）葡聚糖凝胶G-25 （8）DEAE纤维素（9）新鲜血清（10）聚乙二醇（11）双缩脲试剂（12）巴比妥缓冲液（pH8.6,离子强度0.06）：称取巴比妥纳12.76g，巴比妥1.66 g，蒸馏水溶解并定容至1000 mL。

（13）染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解。

（14）漂洗液：甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混匀。

2.器材离心机刻度离心管pH试纸抽滤瓶黑、白反应板透析袋铁架台层析柱（1.5×20cm）移液枪布氏漏斗培养皿电泳仪电泳槽醋酸纤维薄膜培养皿滤纸点样器吸量管镊子吹风机紫外分光光度计【操作方法】（一）血清清蛋白的分离与纯化1.硫酸铵盐析取刻度离心管1支，加入1.0mL新鲜血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵液1.0mL。

混匀后室温下放置10min，4000r/min离心10min。

用滴管小心吸出上清液置于试管中，即为粗清蛋白液。

2.凝胶柱层析脱盐（1）凝胶的处理：量取30 mL 葡聚糖凝胶G-25 ，加入2倍量的0.02mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液，置于沸水浴中1h，并经常摇动使气泡逸出。

取出冷却，待凝胶下沉后，倾去含有细微悬浮物的上层液。

（2）装柱平衡：选用1.5×20cm层析柱，垂直夹于铁架台上。

向柱内加入少量0.02mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液，将上述处理过的凝胶粒悬液连续注入层析柱内，直至所需凝胶床高度距层析柱上口约3~4cm为止。

装柱时应注意凝胶粒装填均匀，凝胶床内不得有界面和气泡，凝胶床面应平整。

打开下口夹，调节柱下端螺旋夹流速2 mL/min，用2倍柱床体积的醋酸铵缓冲液平衡。

关闭下口夹。

（3）上样与洗脱：打开下口夹，使床面上的缓冲液流出，待液面降到凝胶床表面时，关闭出水口。

用滴管吸取盐析所得清蛋白溶液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。

然后打开下口夹，使样品进入床内，直到与床面平齐为止。

立即用1mL 0.02 mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液冲洗柱内壁，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。

如此重复2次，以洗净内壁上的样品溶液。

然后再加入适量缓冲液于凝胶床上，调流速10滴/min，开始洗脱。

用小试管收集流出的液体，每管收集20滴，收集10管后关闭出水口。

（4）检测蛋白质与NH4+：取黑白反应板各一块，按洗脱液的顺序每管取1滴，分别滴入反应板中，在黑色反应板中加300g/L三氯乙酸溶液（或用双缩脲试剂检测）2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，并记录各管白色混浊程度。

于白色反应板中加人奈氏试剂溶液l滴，观察NH4出现的情况。

合并含有蛋白质的各管，即为已脱盐的清蛋白溶液。

3.离子交换层析柱纯化（1）DEAE纤维素处理：量取DEAE-纤维素20mL，加0.5mol/L HCl 溶液50mL，搅拌后放置20min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，再用蒸馏水反复洗数次直至pH 4.0 为止。

加等体积0.5 mol/LNaOH 溶液，搅拌后放置20min，虹吸去除上清液，同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。

然后转移到烧杯内，加0.02mol/LpH 6.5醋酸铵缓冲液40mL放置30min。

待装柱。

（2）清蛋白洗脱与纯化：取层析柱1.5×20cm 1支，按以上装柱方法将处理好的DEAE-纤维素装入柱中，然后用0.02 mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液平衡。

将脱盐后的清蛋白溶液上柱后，用0.06mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液洗脱，流出约6mL后。

将柱上的缓冲液液面降至与纤维素床表面平齐。

再改用0.3mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液洗脱，并用300g/L三氯乙酸溶液或双缩脲试剂检查流出液是否含有蛋白质。

流出液中有蛋白质时，立即收集，即为纯化的清蛋白液，留作纯度鉴定用。

4.蛋白溶液浓缩将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入培养皿内。

透析袋周围撒上聚乙二醇。

经过一定时间后即可观察到明显的浓缩现象。

该浓缩样品留作纯度鉴定。

以上物质在使用后可以通过加温及吹风而回收。

（二）血清清蛋白的鉴定——醋酸纤维素薄膜电泳1、准备电泳2、点样取醋酸纤维薄膜2张，在薄膜的无光泽面的1.5cm处用铅笔轻轻划一条线。

将薄膜浸入pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中，浸泡约30min(膜上没有白色斑痕)。

将完全浸透的薄膜轻轻取出，平铺在滤纸上，用滤纸吸去多余的缓冲液。

分别用点样器蘸取正常血清和清蛋白溶液点在点样线上(粗糙面)。

3、电泳 薄膜的无光泽面向下，两端紧贴在电泳槽支架上的滤纸条上（点样端在阴极）。

薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳，调电流0.5mA/cm 膜宽（几条薄膜就是通几毫安的电流，是按横向计算的），通电时间约40~60min 。

4、染色与漂洗 电泳结束后，关闭电源，将薄膜浸于氨基黑10B 染色液中染色5min ，取出后用漂洗液漂洗4~5次，每次约5min ，待背景无色为止。

（三）血清清蛋白定量测定在紫外分光光度计上，将标准的清蛋白溶液用蒸馏水稀释1000倍小心盛于1cm 的石英比色杯中，以生理盐水为对照，测得280nm 和260nm 两种波长的吸光度。

将280nm 及260nm 波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。

C'= 1.45A280 — 0.74A260式中C'：稀释后清蛋白质量浓度（mg/ml)；A280nm ：蛋白质溶液在280nm 处测得的吸光度；A260nm ：蛋白质溶液在260nm 处测得的吸光度。

本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往较困难。

【结果处理】（一）清蛋白的定性鉴定将两条经染色或透明的醋酸纤维素薄膜进行比较，观察提纯清蛋白区带与正常血清蛋白区带的相应位置。

（二）清蛋白的定量鉴定血清清蛋白浓度C' = 1.45A280 — 0.74A260式中C'：稀释后蛋白质量浓度（mg/ml)；A280nm ：蛋白质溶液在280nm 处测得的吸光度；A260nm ：蛋白质溶液在260nm 处测得的吸光度。

血清清蛋白浓度C=1000C'【注意事项】1.装柱时，不能有气泡和分层现象，凝胶悬液尽量一次加完。

2.加样时，切莫将床面冲起，亦不要沿柱壁加入。

不能搅动床面，否则分离带不整齐。

8cm2cm 点样线点样区 1.5cm(粗面）3.流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。

4.在整个洗脱过程中，始终应保持层析柱床面上有一段蒸馏水，不得使凝胶干结。

5.实验中需要高质量的适应比色杯。

【思考题】1.葡聚糖凝胶层析法分离纯化蛋白质的原理是什么？2.制备蛋白质类制剂需注意哪些问题？3.简述血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳原理。