蛋白质分离纯化

简述蛋白质分离纯化的基本方法蛋白质是有机体重要的组成部分，由氨基酸编码，执行了多种生物功能，例如促进新陈代谢，生物合成，免疫等。

为了获得高纯度的蛋白质，必须将其从其他成分中分离和纯化。

这就是蛋白质纯化。

蛋白质纯化的基本方法包括：一、分子大小法蛋白质主要通过分子过滤器来分离和纯化。

该过程基于分子间的亲和性原理，通过过滤器膜的通透性以及不同蛋白质的大小差异将蛋白质从溶液中分离出来。

二、萃取技术萃取技术是基于蛋白质的共沉淀特性，通过不同的有机溶剂来区分和分离蛋白质，将沉淀的蛋白组分收集后，再进行精细回收。

三、离子交换技术离子交换技术也是基于蛋白质的离子属性，采用各类加压装置，以及特殊离子交换模块以及合成模块，来实现将收集物分离筛选后回收。

四、双模立体技术双模立体技术是采用两种不同的液体体系，如水基和有机溶剂基，在不同的状态或浓度下对蛋白质进行再离析技术，从而实现蛋白质的有效分离纯化。

五、凝胶精分技术凝胶精分技术是改良和发展起来的一种新型蛋白质分离纯化技术，主要基于交叉链结构，可以基本上实现同一类分子配体分子完整地分离纯化。

六、共晶引擎技术共晶引擎技术可基于共晶相邻能量差异，通过电荷，配体结合等不同形式来改变分子的邻近能量，从而有效的将蛋白质分离出来。

以上就是蛋白质分离纯化的基本方法，可以从不同的角度神明蛋白质的性质，以达到有效的提纯的目的。

蛋白质的分离纯化对解析有机体内蛋白质的结构和功能，也极为重要。

目前，已经有很多高级的技术和模块来实现蛋白质分离纯化，例如蛋白质分子调控，杂交等。

通过有效利用上述方法，可以有效精细和完整得提纯高纯度的蛋白质。

蛋白质分离纯化的方法分离纯化蛋白质的四种关键性方法分离蛋白质的方法有许多种，应根据原材料和生产条件来选择具体的分离纯化方法。

例[5][6]如:李凤英等用盐溶法提取葡萄籽的蛋白质。

李喜红等用酶法从脱脂米糠中提取蛋白质。

[7]郭荣荣等碱法与酶法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究得出结论是碱法提取的大米蛋白持水性、吸油性和起泡性优于酶法提取的大米蛋白，而酶法提取的大米蛋白的溶[8]解性、乳化稳定性和泡沫稳定性优于碱法提取的大米蛋白。

王桃云等就是运用这种方法配[9]合使用加热法提取葎草叶蛋白。

陈申如等用酸法提取了鲢鱼鱼肉蛋白质，提取的蛋白质无腥味，色泽洁白，蛋白质产率高，可达90%左右。

以下介绍四种分离纯化蛋白质的方法。

1区带离心法区带离心法是分离蛋白质的有效而且常用的方法。

该法的第一步是在离心管中形成一个密度梯度(常用蔗糖梯度)，然后将待分离的蛋白质混合液放在密度梯度顶端。

超速离心时，蛋白质即通过密度梯度移动，并根据其沉降系数而被分开，最后各种蛋自质在离心管内被分离成各户独立的区带，可以在管底刺一小孔逐滴放出，分部收集。

2 层析法最常用的层析法是凝胶过滤和离子交换柱层析。

[10-12]2.1 凝胶过滤(GFC)凝胶过滤也叫凝胶色谱和分子筛层析，是利用凝胶的网状结构根据分子的大小和形状进行分离的方法。

凝胶过滤是一种快速而简便的分离分析技术，可用于蛋白质的脱盐、分离、提纯、分析等等。

柱中的填充料是水合程度高而不溶的碳水化合物高聚物，最常用的是葡聚糖凝胶〔其他有聚丙烯酞胺凝胶和琼脂糖凝胶等)。

仙聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，不同型号的葡聚糖凝胶其“网眼”大小不同，可以用来分离纯化不同分子大小的物质。

当蛋白质混合物通过层析柱时，比“网眼”大的蛋自质分子不能进入凝胶颗粒内部，不能沿着颗粒间隙流动，流程短，流速快，最先流出柱外;比“网眼”小的分子则进入凝胶颗粒内部，沿着孔道移动，从一个颗粒流出，又进入另一颗粒，所以下移速度慢，随后被洗脱下来。

蛋白质的分离纯化方法蛋白质是细胞中的重要生物大分子，具有多样的结构和功能。

为了研究蛋白质的性质和功能，需要将蛋白质从混合样品中分离纯化出来。

蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括离心法、电泳法、层析法和亲和纯化法等。

下面将逐一介绍这些方法及其原理。

1. 离心法离心法是利用离心机将混合物中的蛋白质分离出来。

首先将细胞裂解，得到细胞裂解液，然后进行离心，以将细胞器、胞外物质和亲粒子（如蛋白质颗粒）分离。

离心可以根据不同物质的相对密度和大小进行分层分离，快速旋转离心机可以很好地分离出不同密度的颗粒。

2. 电泳法电泳法是将带电的蛋白质沿着电场移动，根据蛋白质的带电性质和大小分离的方法。

蛋白质可以根据电荷性质分为阴离子蛋白和阳离子蛋白，也可以根据亲水性质分为亲水性蛋白和疏水性蛋白。

电泳法常用的有SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。

其中，SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量进行分离。

3. 层析法层析法是通过蛋白质与载体之间的亲和性或者分离介质之间的亲和性进行分离的方法。

层析法主要分为凝胶层析、离子交换层析、亲合层析和大小排阻层析等。

凝胶层析法是利用凝胶的网格结构来分离蛋白质，如凝胶过滤层析、凝胶过渡层析等。

离子交换层析法是利用蛋白质对离子交换树脂的吸附性质进行分离。

亲合层析法是通过亲和柱中的配体与蛋白质的亲和作用进行分离。

大小排阻层析法是根据蛋白质的分子量和形状进行分离。

4. 亲和纯化法亲和纯化法是利用特定的亲合剂与目标蛋白质之间的特异性亲和性进行分离纯化的方法。

亲和纯化主要包括亲和柱层析法、浸没纯化法、亲和剂电泳法等。

亲和柱层析法是将具有亲和填料的柱子与样品接触，通过洗脱再生的操作，将目标蛋白质从其他组分中分离纯化出来。

浸没纯化法是将特定亲合剂浸泡在蛋白质混合物中，使其与目标蛋白质发生亲和结合，然后以特定条件洗脱目标蛋白质。

亲和剂电泳法是负载亲和剂的凝胶片上进行电泳，使蛋白质与亲和剂结合，再通过电泳将其分离纯化出来。

蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。

根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。

透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。

透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。

超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。

这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。

它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。

由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。

所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。

当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。

例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。

使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。

常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。

可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。

密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。

蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。

凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。

凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。

常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。

这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。

在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。

(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法:1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。

被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。

能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。

此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。

由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。

分离纯化蛋白质的方法及原理蛋白质是构成生物体内的一类重要有机物，其在细胞内扮演着结构支架、酶、传导、信号、调节等多种重要生理功能。

为了研究蛋白质的组成、结构和功能，需要从生物体中分离纯化某一特定的蛋白质。

本文将介绍常见的分离纯化蛋白质的方法及其原理。

一、离心法离心法是利用分子质量和形态的差异分离纯化蛋白质的方法。

通常采用超速离心或超高速离心将混合蛋白质体系分层，然后将目标蛋白质提取出来。

这种方法适用于分离纯化大小和形态差异较大的蛋白质，如细胞器和病毒。

二、电泳法电泳法是利用蛋白质的电荷和大小的差异进行分离纯化的方法。

常见的电泳方法包括凝胶电泳、等温点电泳和免疫电泳等。

其中，凝胶电泳是最常用的方法，可以将混合的蛋白质按照分子大小和电荷分离成不同的带状图案，利用电泳隔离其目标蛋白质。

这种方法适用于分离纯化分子大小和电荷差异较大的蛋白质。

三、层析法层析法是利用固相材料与溶液中成分的亲和性差异分离纯化蛋白质的方法。

常见的层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆向相层析等。

这种方法适用于分离纯化不同大小、电荷、极性、疏水性质的蛋白质，是目前最常用的方法之一。

四、沉淀法沉淀法是利用溶液中加入特定的沉淀剂，使混合物中特定的蛋白质析出并沉淀的方法。

常用的沉淀剂包括羧酸、硫酸铵、三氯乙酸等。

沉淀法不需要昂贵的设备，操作简单，但分离得到的目标蛋白质可能含有杂质，需要进行进一步的纯化。

五、抽提法抽提法是利用特定溶剂或添加物将混合蛋白质中的目标蛋白质从其他成分中抽取出来的方法。

常用的抽提方法包括盐溶液、酸碱溶液、氨水、磷酸盐缓冲液等。

这种方法适用于分离纯化对特定溶剂或添加物具有亲和性的蛋白质。

综上所述，分离纯化蛋白质的方法有很多种，每种方法的适用性取决于目标蛋白质的特性。

研究人员在选择方法时需要根据实验条件、目的、样品特点等综合因素进行选择。

蛋白质分离纯化的基本步骤蛋白质分离纯化分为四个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎(二)蛋白质的抽提（三）蛋白质粗制品的获得（四）样品的进一步分离纯化。

蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。

（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。

常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。

这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。

在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。

被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。

能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。