磁化水结合超声波辅助Alcalase 2.4L FG酶水解绿豆蛋白的工艺研究
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一中国食品添加剂 堕婴 磁化水结合超声波辅助Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ酶 水解绿豆蛋白的工艺研究
王凯凯 ，曹荣安 ，张丽萍Ｌ ， （１．黑龙江八一农垦大学，大庆１６３３１９；２．国家杂粮工程技术研究中心，大庆１６３３１９） 摘要：利用Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ酶制备绿豆肽时对绿豆蛋白进行磁化水溶解、超声波预处理。以可溶性 蛋白含量为检测指标，研究磁化水、超声波处理时间、超声波功率、超声波处理温度对绿豆可溶性蛋白含量 的影响，进而以水解度为指标，研究底物浓度、温度、酶浓度和ｐＨ对Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ酶水解效果的影响， Ｌａｅｍｍｌｉ—ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表征水解肽的分子量分布。结果表明：磁化水溶解可提高绿豆可溶性蛋白含量，超 声波预处理的最佳工艺参数为：４５℃、２０ｍｉｎ、２２５Ｗ；Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ碱性蛋白酶水解的最适条件为：底物 浓度５．２７％、加酶量３．０１％、ｐＨ８．５、温度６０Ｃ。Ｌａｅｍｍｌｉ—ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析结果显示，该方法得到的水解肽分 子量分布范围广，６．５ＫＤａ以下含量较高，水解效果较好。 关键词：超声波；磁化水；碱性蛋白酶；Ｌａｅｍｍｌｉ—ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 中图分类号：ＴＳ２０２．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—２５１３（２０１５）０７—００８３—１０
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍａｇｎｅｔｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４ Ｌ ＦＧ ｅｎｚｙｍｅ
ＷＡＮＧ Ｋａｉ－ｋａｉ ，ＣＡＯ Ｒｏｎｇ－ａｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉ－ｐｉｎｇ ・ ， （１．Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｂａｙｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ １ ６３３ １ ９； ２．Ａｇｒｉ—Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｄａｑｉｎｇ １６３３１９）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ ｄｉｓｓｏｌｖｅ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｈｅ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｙ Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ．ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ． ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ２．４Ｌ ＦＧ Ａｌｃａｌａｓｅ ｗａｓ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｕｓｉｎｇ Ｌａｅｍｍｌｉ—ｓｄｓ－ｐａｇｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ ｃａｒｌ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｍｕｎｇ ｂｅａｎｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ，ｏｐｔｉｍｕｍ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｒｅ：４５℃，２０ ｍｉｎ，２２５ｗ．Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ：ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ３．０１％，ｅｎｚｙｍｅ ａｍｏｕｎｔ ５．２７％，ｐＨ８．５， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ６０Ｃ．Ｌａｅｍｍｌｉ—ｓｄｓ—ｐａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉＳ ｗｉｄｅ ａｎｄ ｂｅｌｏｗ ６．５ ＫＤａ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉＳ ｓｔｉｌｌ ｈｉｇｈ．ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔ ｉｓ ｇｏｏｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ；ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｌ ｌａｅｍｍｌｉ—ｓｄｓ—ｐａｇｅ
绿豆（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔｅ）营养成分丰富，其蛋 白质质量分数高达１９．５％～３３．１％，远高于一般 收稿日期：２０１５—０６—１４ 作者简介：王凯凯（１９９１一），男，硕士研究生，研究方向为食品科学。邮箱：ｗａｎｇｋａｉｋａｉｆｈ＠１６３．ＣＯｆｆｌ。 通信作者：张丽萍（１９５７一），女，教授，博士，研究方向为食品科学。 中国食品添加剂 Ｃｈｉｎａ ＦｏｏｄＡｄｄｉ 试验研究
禾谷类粮食，并具有良好的功能特性。绿豆中蛋 白的氨基酸种类齐全，尤以赖氨酸含量较为丰富 为６．９ｇ／１６ｇＮ，接近鸡蛋蛋白质中赖氨酸的含量 ７．２ｇ／１６ｇＮ…。绿豆蛋白经水解处理，可制备低分 子肽类物质，其氨基酸组成和结构与绿豆蛋白相 比几乎没有改变，但相对分子质量较小，具有水 溶性高、黏度低、稳定性强等优点，从而可有效 提高其应用价值。 绿豆肽的制备目前多采用酶法处理Ｌ２】，而 使用生物物理与生物工程技术结合进行前处理的 方法少见报道。磁化水是普通水静置于磁场，或 以一定流速垂直地经过磁场切割磁力线后被磁 场磁化了的水。与普通水相比，磁化水ｐＨ和 电导率Ｂ 有所增大，渗透性增强、溶解能力增 加 ，除此之外，磁化水分子运动加快具有很 高的能量［６Ｉ，能加速化学反应速率。超声波是频 率高于２００００Ｈｚ的声波，具有空穴作用和机械剪 切作用，能改变蛋白质的化学结构，促进绿豆蛋 白的水解。因此，试验采用磁化水作为溶剂，超 声波预处理绿豆蛋白，以增加溶液中可溶性绿豆 蛋白含量，辅助Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ酶水解绿豆蛋 白以提高水解度，并优化了工艺参数。对此法得 到的绿豆肽进行Ｔｒｉｃｉｎｅ—ＳＤＳ～ＰＡＧＥ电泳，确定 其相对分子量分布。酶解得到的低聚肽和氨基酸 混合物，作为食品添加剂、生物活性制剂等具有 广泛的应用价值。 １材料与方法 １．１实验材料 绿豆蛋白：实验室自制（蛋白质含 量８７．３％）；Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ碱性蛋白酶（酶 活力１００万ｕ．ｇ ）：诺维信公司；丙烯 酰胺（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、甲叉双丙烯酰胺（Ｂｉｓ— ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、过硫酸铵（ＡＰＳ）、Ｔｒｉｓ碱、十 二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸二钠 （ＴＥＭＥＤ）、溴酚蓝、考马斯亮蓝Ｒ－２５０：上海生 物工程有限公司；低分子量蛋白质标准品：日本 Ｔａｋａｒａ生物公司；氢氧化钠、盐酸、戊二醛、甘 油、乙二醇等其他常用试剂：国药集团化学试剂 有限公司。 １．２仪器设备 磁化水机：ＫＷＤ—Ｓ１０１（ＫＴ），韩国；超声 波处理仪：ＦＳ一４５０Ｎ，上海斯祁科学仪器有限公 司；自动凯氏定氮仪：ＳＫＤＡ一８００，上海沛欧分 析仪器有限公司；冷冻干燥机：Ｃｏｏｌｓａｆｅ ＴＭ ５５ １１０—４Ｌ／５５—９Ｌ，环球分析测试仪器有限公司；精 密ｐＨ计：Ｓ４０ＫＣＮ，梅特勒～托利多仪器有限公 司；恒温水浴锅：ＨＨＳ２卜４，北京长安科学仪器 厂；电动搅拌器：江苏省金坛市医疗仪器厂；电 热鼓风干燥箱：１０１型，北京市永光医疗仪器厂； 低速离心机：上海市手术仪器厂；电子天平：上 海上天精密仪器有限公司；ＰｏｗｅｒＰａｃＴＭ基础电 泳仪电源、Ｍｉｎｉ～ＰＲＯＴＥＡＮ￣Ｔｅｔｒａ电泳槽：Ｂｉｏ— ｒａｄ中国公司。 １．３工艺流程 绿豆蛋白一磁化水溶解一超声波预处理一调 ｐＨ一酶解（Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ酶）一１００℃加热 １０ｍｉｎ（灭酶活）一离心一上清液冷冻干燥一绿 豆肽 １．４指标测定 酶活力的测定采用Ｆｏｌｉｎ一酚法，参照ＧＢ／ Ｔ２３５２７—２００９；蛋白质含量测定采用微量凯氏定 氮法，参照ＧＢ５００９．５—８５；可溶性蛋白含量采用 考马斯亮蓝法［７１；水解度（Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ， ＤＨ）的测定ｐＨ—Ｓｔａｔ法【８１。 １．５实验方法 １．５．１磁化水与蒸馏水对比实验 取绿豆蛋白１０ｇ分别加１００ｍＬ蒸馏水和磁化 水溶解，恒温（温度３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、 ５５℃）水浴搅拌６０ｒａｉｎ。分别测定其在不同温度 下可溶性蛋白的含量（％），每组平行测定３次， 取平均值。 １．５．２超声波预处理工艺优化 （１）单因素实验 以可溶性蛋白含量（％）为指标，选择超声 预处理温度（℃）、超声预处理时间（ｍｉｎ）、超 声预处理功率（ｗ）进行单因素实验，按表ｌ进 行实验水平设计。除要研究的单因素为变量外， 其他因素控制为：超声预处理温度为５０＂Ｃ，超声 预处理时间为２０ｍｉｎ，超声波功率１３５Ｗ的条件 下进行。 表１单因素实验水平表 Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
（２）正交实验 在单因素的基础上，选取超声预处理功率 （ｗ）、超声预处理温度（℃）、超声预处理时间 （ｍｉｎ）三个因素，利用Ｌ （３ ）正交表进行正交 优化实验，见表２。
表２正交实验因素水平表 Ｔａｂｌｅ ２ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
１．５．３绿豆蛋白酶解最佳工艺条件优化 （１）单因素实验
表３单因素水平表 Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ 水平底 度 力
１ ３ ４５ ｌ ７．５ ２ ４ ５０ ２ ８．０ ３ ５ ５５ ３ ８．５ ４ ６ ６０ ４ ９．０ ５ ７ ６５ ５ ９．５
选取Ａｌｃａｌａｓｅ ２．４Ｌ ＦＧ碱性蛋白酶对超声预 处理后的蛋白质进行水解，以水解度为指标，选 择底物浓度（％，ｇ／１００ｍＬ水）、温度（℃）、加 酶量（％，ｍＬ／１０ｇ底物）和ｐＨ进行单因素实 验，按表３进行实验水平设计，测定不同条件下
