生物素—链霉亲和素技术一步法检测淋球菌抗原的研究
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第２。卷举 ‘啼 江文学学Ｅ报 （Ｙ医Ｍ学Ｅ 版２０００ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＺＨＥＪＩＡＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ阜 ’ ） Ｖｏ１ ２９ Ｎｏ ６ ０００ ２； 一ｚ ２
生物素一链霉亲和素技术一步法检测淋球菌抗原的研究 瓠娥。 ７钾， （Ｉ．浙江大学医学院，浙江杭州３１００３１￣２．浙江大学附属第二医院．浙江杭州３］０００９｛３．浙江省人民医院．浙江杭娴３１００１４） 摘要：目的：建立一种灵敏、快速诊断淋球菌感染的酶免疫测定法。方法：硷刹淋球菌抗原的生物 素一链霉亲和素酶联免疫一步法。结果：３６例临康淋球菌标本中淋球菌抗原含量１０８．４７±５１．３９ ｇ／Ｌ，阳性率９７．２ ，显著高于非淋球菌标本的４．７１±２．１ ３ ｇ／Ｌ，阳性率Ｏ （Ｐ均＜Ｏ．０１），本法 检测灵敏度０．６２５ ｇ／Ｌ，特异性１ｏ０％，敏感性９７．２ 。结论：该法可作为灵敏、快速诊断淋球菌的 新的辅且力！兰：１、／—、 葶键孽：墨 垦韭 《 ／免疫学； 竺￡ 圭堕 酶 中图分类号
：Ｒ４４６．６１ 文献标识码：Ａ ｊ 文章编号 联免疫吸附测定； 生物毒一链霉亲和素
：１００８—９２９２（２０００）０６—０２５０—０３
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ａｎ Ｏｎｅ－・ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍ－・ ｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｔｉｎ—ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ＳＨＥＮ Ｊｉａｎ—ｇｅｎ，ＺＨＵ Ｙｏｎｇ—ｌｉａｎｇ，ＤＯＮＧ Ｙｕ—ｅ（ＣｏＨｅｇｅ ｏｆＭｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｉｎ— ｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｎ ｏｎｅ—ｓｔｅｐ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｂｉｏｔｉｎ—ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｆｏｒ Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ３６ ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ １０８．４７±５１．３９ ｔ￣ｇ／Ｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｗａｓ ９７．２ ，Ｂｏｔｈ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｎｏｎ— Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｓａｍｐｌｅｓ ＜Ｏ．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ！Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｎｅｗ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ／ｉｍｍｕｎｏｌ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ；Ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍ． ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；Ｂｉｏｔｉｎ．Ｓｔｒｅｐｔａｖｌｄｉｎ
多年来淋病的发病率一直居性传播性疾病 的首位。实验室检查是淋病诊断、疗效观察及治 愈判定的重要依据之一。其中分离培养法为首 选，但该法不能及时报告结果，使其在临床应用 中受到一定限制。研究和建立快速、敏感、特异 的淋球菌检测方法，对于治疗和控制淋病传播 和蔓延无疑具有重要意义。 我们在制备抗淋球菌苴克隆抗体（ｍｏｎｏ ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭｅＡｂ）工作的基础上Ｌ１］，建 立了生物素一链霉亲和素技术一步法检测淋球 菌抗原，该法具有较好的敏感性和特异性，而且 操作简便，现将结果报道如下。 １材料和方法 １．１试剂生物素（Ｓｉｇｍａ公司），链霉亲和素 （Ｓｉｇｍａ公司），ＣＮＢｒ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｒｃｉ ａ公司），羊抗兔酶标记抗体（浙江大学医学院 附属第二医院消化实验室赠送），抗淋球菌 ＭｃＡｂ、免抗淋球菌多克隆抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＰｃＡｂ）均为本实验室制备，四甲基联
收稿日期：】９９９＋】０—２０幡旬日期：２０００—０３—２０ 基垒项目；浙江省卫生厅资助课题 作者简卉－沈建棍（１９５２一）．男，副研究员，硬士生导师，主要 从事抗感染免疫和肿瘤免疫的研究．
（兰） 维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期 沈建根．等．生物束一链霉亲和素技术一步涪检测淋球苗抗原的研究 苯胺盐酸盐（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ公司） １．２样本淋球菌临床分离菌株３６例（经培 养后涂片革兰氏染色、免疫、生化鉴定获得）。淋 球菌２９１０６—５标准株（引自中国药品生物制品 检定所） 衣原体阳性培养物１５例（杭州市三医 院提供） 金黄色葡萄球菌７株、白色葡萄球菌 ３株、溶血性链球菌４株、肺炎链球菌１株、脑 膜炎双球菌５株、大腑杆菌２株、绿脓杆菌１ 株，由本校微生物学教研室提供的保存菌株。 １．３淋球菌标准品的制备 采用亲和层析柱 法 将抗淋球菌ＭｃＡｂ与ＣＮＢｒ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ按操作步骤交联 将收获浓缩的淋球菌 （２９１０６—５株）加入１ Ｔｒｉｔｏｎ一１Ｏ０室温搅拌２ ｈ，再进行超声粉碎（３０ ｓ×８次），离心去沉淀， 上清液过ＭｃＡｂ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ柱（流速１ ｍｌ／ ｒａｉｎ），用ｐＨ ７．４，０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ缓冲液（含 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ）洗涤至无蛋白流出为止（用 ５ 磺柳酸鉴定） 最后用０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ２ ８甘 氨酸～盐酸缓冲液解吸，收集解吸液，调ｐＨ至６ ～７，对生理盐水透析除盐，浓缩，蛋白定量，备 用。 １．４生物素化ＭｃＡｂ的制备按文献报道制 备ｌ２］。制备好的生物素化ＭｃＡｂ悬浮于３Ｏ 甘 油ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ ７．４，０ ０１ ｍｏｌ／Ｌ）中，４℃保 存 １．５生物素一链霉亲和素一步法检测淋球菌抗 原将链霉亲和素以１０ ｍｇ／Ｌ（ｐＨ ９ ６ ０ ０５ ｍｏｌ／Ｌ碳酸缓冲液）浓度包被微孔（１００ ／ 孔），４℃过夜，次日取出，洗涤３次（洗涤液用 ０．０５ 吐温２０，ｐＨ ７．４ ０ 。】ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ），用 １０ 小牛血清３７℃封闭３０ ｒａｉｎ，洗涤３次，加 入生物素化ＭｃＡｂ ４０ １（１：１００），待检样本或 不同浓度的标准品（２００、１００、５Ｏ……３ １２ ｇ／ Ｌ）４Ｏ ｌ，兔抗淋球菌ＰｃＡｂ（１ ８００）４０ ｌ，３７℃ 反应６０ ｍｉｎ后，洗涤３次，加入羊抗兔酶标抗 体１Ｏ０ １／孔，３７‘Ｃ反应３０ｒａｉｎ，洗涤３次，加入 １Ｏ０ １／孔ＴＭＢ，显色５～１０ ｒａｉｎ，用２ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ ５０ １／孔终止反应，以 ＝４５０ ｒｓｍ处测 各孔吸光埴（Ａ），绘制标准曲线，根据标准曲线 计算各样本值。 １ ６常规酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）采用 双抗体夹心法。取１０ ｍｇ／Ｌ ＭｃＡｂ以１００ ｌ／孔 包被微孔，４℃过夜，次日取出，洗涤３次，１Ｏ 小牛血清３７℃封闭３０ ｒａｉｎ，洗涤３次，加入待 检样本和不同浓度的标准品系列，３７℃反应６０ ｒａｉｎ，洗涤３次，加入ｌ：８００兔抗淋球菌 ＰｃＡｂ，３７℃反应６０ ｍｉｎ，洗涤３次，加入羊抗兔 酶标抗体，３７℃反应６０ｍｉｎ，洗涤３次，加ＴＭＢ 底物显色定量 １．７不同方法处理淋球菌对测定结果的影响 ①１ Ｔｒｉｔｏｎ一１０Ｏ室温（１８～２５℃）搅拌２ ｈ， 再超声粉碎（３Ｏ ｓ×８次），３ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心ｌ０ ｍｉｎ，收集上清 ②超声粉碎 在冰水浴下超声 粉碎（３０ ｓ×８次），３ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｒａｉｎ，收 集上清。⑧冻融：将一３０℃保存的菌液转至室 温，待融化后再移入一３０℃冰箱，同法反复冻融 ８次，３ ０００ ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｍｉｎ，收集上清。④对 照：未经上述处理４℃保存菌液，３ ０００ ｒ／ｍ￣ｎ离 心１０ｒａｉｎ，收集上清。 １．ｓ方法学质控以同一样品不同日期连续 检测１０次计算批间差异，以同一样品同一时间 检测２０次计算批内差异。同时评价方法灵敏 度。 １．９统计学处理两组淋球菌含量以 士 表 示，比较采用ｔ检验，阳性率比较采用 检验。 特异性和敏感性检验参照文献口］。
２结果 ２．１ 淋球菌抗原测定方法反应标准曲线（图 １）淋球菌抗原含量与吸光度Ａ值呈正比，淋 球菌含量越高，Ａ值越大，反之亦然。本方法检 测灵敏度为０ ６２５ ｇ／Ｌ，相当于３ ５×１０ ／ｍｌ 淋球菌，而同时进行常规ＥＬＩＳＡ测定时，其灵 敏度为１．２５ ／Ｌ。
ｌ＿００ ０ ７５ 舌 ０－５０
０ ２５ ０．ＯＯ ０ ６２５ １．２５ ２ ５Ｏ ５．００ １０．００ ２０．。０
蛋白浓度（ｕ ｇ／Ｌ）
图ｌ淋球苗抗原测定方涪反应标准曲线
维普资讯 http://www.cqvip.com 浙江大学学报（医学版） 弟２９卷 ２．２淋球菌及各类菌株抗原测定结果淋球 菌抗原含量为１０８．４７±５１．３９ ｇ，Ｌ显著高于 非淋球菌标本的４．１７士２．１３ ｇ／Ｌ，Ｐ＜０．０１ 若以≥非淋球菌均值２倍 上为阳性，则淋球 菌组阳性率９７．２ ，非淋球菌组阳性率０ ，Ｐ ＜０．０１ 本法对淋球菌检测的特异性为１００ ， 敏感性为９７．２ （３５／３６）。 ２．３不同方法处理淋球菌对测定结果的影响 （图２） 结果表明反复冻融法、ｌ Ｔｒｉｔｏｎ １００ 和超声粉碎法对淋球菌抗原释放影响不明显。 提示淋球菌抗原易从茵体表面脱落。 舌 ０ ７Ｏ ６。 ０ ５０ ０ ４０ ０ ３０ Ｏ ２Ｏ ｏ．１Ｏ ０ Ｏ０ 次数 图２不同方法处理ｉ棒球菌对测定结果的影响 ２．４本方法的批内差异为３．９７ ，批间差异 为９．２０ 。 ３讨论 酶联免疫测定法是目前鉴定淋球菌抗原较 理想辅助方法之一 ４ ］。该法可弥补涂片革兰 氏染色法对女性患者检查敏感性不高的缺点， 且可满足对不同人群普查需求。然酶免法整个 操作过程仍需３～４ ｈ，简化操作步骤、缩短检 测时间是方法学探讨的一个重点。我们已成功 制备了５株抗淋球菌ＭｃＡｂ，其与淋球菌反应 率达１００ ，与脑膜炎球菌、葡萄球菌、大肠杆 菌等ｌ５种微生物不起反应 】］。并在此基础上建 立了生物素。链霉亲和素技术一步法检测淋球 菌抗原方法。用链霉亲和素替代抗体包被微孔， 避免了抗体包被微孔时容易发生失活（或不易 保存），具有阴性对照、空白对照本底低，检测敏 感性高的优点，有利于质控及向商品试剂盒过 渡 本法采用ＭｃＡｂ一淋球菌抗原一ＰｃＡｂ夹心 模式，ＭｃＡｂ仅识别结台某一抗原决定簇，而不 与该抗原的其他抗原决定簇反应，而后者恰是 ＰｃＡｂ可结合位点，因此在抗体与优势抗原发 生结合时，不发生竞争位点现象，故ＭｃＡｂ和 ＰｃＡｂ可混合或同时加 有学者认为二种抗体 同时加量时形成的抗原抗体复台物较大，检测 敏感性可略高于通用的二步法，且可减少加样 步骤和洗涤次数，缩短反应时间，使方法更简 便 本文结果表明生物素一链霉亲和素一步法 检ｉ赠淋球菌抗原敏感性９７．２ ，特异性１００ ， 批内、批间差异分别为３．９７ 、９．２Ｏ ，反应时 间９０ ｍｉｎ，而同时进行常规ＥＬＩＳＡ测定时，其 灵敏度为１．２５ ｇ／Ｌ。且在试验中发现，对淋球 菌预处理与否并不影响结果，提示本法已达到 临床应用要求。但我们在实验中发现淋球菌抗 原在淋球菌茵体表达量不高，需淋球菌数达≥ ３．５×１０‘／ｍｌ以上才能被检测，能否进一步提 高其检测灵敏度，需进一步研究
