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生物素-亲和素反应的放大技术

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临床医学检验技师初级(师)临床免疫学及检验(生物素-亲和素免疫放大技术、免疫组织化学技术)-试卷1

临床医学检验技师初级(师)临床免疫学及检验(生物素-亲和素免疫放大技术、免疫组织化学技术)-试卷1

临床医学检验技师初级（师）临床免疫学及检验（生物素-亲和素免疫放大技术、免疫组织化学技术）-试卷1(总分：74.00，做题时间：90分钟)一、 B1型题(总题数：1，分数：6.00)A．1～3B．2～4C．3～5D．2：1E．1：2（分数：6.00）(1).每个抗原标记几个生物素分子为宜（分数：2.00）A. √B.C.D.E.解析：(2).每个抗体标记几个生物素分子为宜（分数：2.00）A.B.C. √D.E.解析：(3).生物素与IgG比值为多少时，效果较好（分数：2.00）A.B.C.D. √E.解析：解析：每个蛋白质上标记的生物素分子数量应控制在一定范围。

二、 A1型题(总题数：26，分数：52.00)1.ABC—ELISA将酶标记在（分数：2.00）A.亲和素B.生物素√C.抗体D.补体E.抗原解析：解析：酶标记生物素分子，与亲和素按一定比例混合，形成亲和素一酶标生物素复合物。

2.关于活化生物素，下列叙述错误的是（分数：2.00）A.利用生物素的羧基加以化学修饰制成的各种活性集团的衍生物B.可容易与各种抗原、抗体、酶及核酸相应集团耦联C.广泛分布于动植物组织，可从卵黄囊和肝脏中提取√D.有标记蛋白质氨基的活化生物素E.有标记蛋白质醛基的活化生物素解析：解析：生物素广泛分布于动植物组织，可从卵黄囊和肝脏中提取。

活化生物素是化学基团修饰后的生物素。

3.关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（分数：2.00）A.根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B.活化生物素与待标记抗原或抗体可以是任意比例√C.在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后不影响后者的免疫活性E.生物素标记酶时会影响其免疫活性解析：解析：生物素标记蛋白质的注意事项包括：①根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件。

9章生物素亲和素

9章生物素亲和素
物－活化生物素 (生物素化衍生物)
生物素活化
标记蛋白质醛基的活化生物素
标记蛋白质巯基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
三、生物素标记蛋白质
1. 标记方式 生物素化蛋白质衍生物有二类： 一种是生物素化的大分子生物活性物 质（如生物素化抗原、抗体） 另一种是标记材料（如酶）结合生物 素后制成的标记物（如生物素 化酶）。
亲和素与链霉亲和素不同点
特点 等电点 分子量(KD) 是否有糖基 非特异吸附

AV 10.5 67 有 多
SAV 6 .0 65 无 少
三、SA和SAV的标记物 几乎所有用于标记的物质均可以同AV和 SAV结合， 125I、胶体金、荧光素、化学发光物 等 小分子物质 酶、抗原、抗体等大分子物质


BAS技术基本类型
1.BAB法（biotin--avidin bind，BAB ）， 也称为桥联亲和素－标记生物素法 （BRAB） 2.标记亲和素-生物素法（BA） （labeledavidin-biotin，LAB）


BAS技术基本类型
BAB法


（biotin--avidin bind，BAB）
及既可偶联生物大分子，又可连接荧光
素、酶等标记材料的特性，使该系统在
标记免疫分析技术领域中的应用具有很
强的稳定性和适用性。
第二节

生物素的理化性质及其标记物
一、生物素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H，辅酶R 分子量-----244.31 广泛分布于动、植物组织中，常从含 量较高的卵黄和肝组织中提取。生物素分 子有两个环状结构

主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术

主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术

第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。

生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。

生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。

一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。

生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。

（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。

BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。

从而使蛋白质标记上生物素。

（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。

BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。

（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。

（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。

二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。

2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。

（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。

2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。

生物素亲和素

生物素亲和素



分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP


亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：

选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力


概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。

生物素-亲和素免疫放大技术

生物素-亲和素免疫放大技术

第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。

二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。

（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。

标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。

（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。

标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。

三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。

2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。

3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。

亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。

四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。

生物素-亲和素标记技术完整讲解

生物素-亲和素标记技术完整讲解

4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡 2.上样 3.洗杂 4.洗脱
五 反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。
1包被抗原2洗涤3待测抗体4洗涤5生物素标二抗6洗涤7加亲和素8洗涤9加酶标生物素10洗涤11加底物12显色后加终止液直接法步骤2亲和素生物素过氧化物酶法abc法即亲和素生物素过氧化物酶法avidinbiotincomplextechnologyabc其原理是预先按一定比例将亲和素或链霉亲和素与酶标生物素结合形成可溶性的亲和素或链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物当其与检测反应体系中的生物素化一抗直接法或生物素化二抗间接法相遇时复合物中未饱和的亲和素或链霉亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合
磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
4.1.4 在免疫酶技术中的应用
BAS应用于免疫酶技术，通过生物素-亲和素将免疫复 合物与辣根过氧化物酶连接起来，形成免疫酶-生物素-亲 和素法。赵金富等用合成的雌三醇-生物素复合物(E3Biotin)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作
BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联， 先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与 抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物， 再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合， 最终使反应信号放大。 李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗， 最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定， 结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星， 与传统放射性同

生物素亲和素

生物素亲和素篇一：生物素标记蛋白操作方法下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。

1、溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。

如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。

计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。

2、在打开之前，平衡生物素至室温。

加2mgSulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

（见下表）3、室温30分钟，或冰上放置2小时。

4、用30mlPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。

5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。

6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。

HABA法检测生物素标记效果试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mMNaclPH7.2）②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mMHABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。

如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。

比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：1、吸取900ulHABA/亲和素溶液于1ml比色杯。

2、测定该溶液在500nm处的'吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。

3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin(数值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。

生物素-链霉亲和素,作为荧光标记

生物素-链霉亲和素，作为荧光标记一、生物素-链霉亲和素的定义生物素-链霉亲和素是一种用于标记生物分子的荧光标记物。

它是由生物素和链霉亲和素组成的复合物。

生物素是一种维生素B7，也称作维生素H，它与链霉亲和素的结合具有较高的亲和力。

链霉亲和素则是一种可以与生物素结合并发出荧光的物质。

将生物素-链霉亲和素与所需标记的生物分子结合后，可以利用链霉亲和素的荧光发射信号来对生物分子进行检测和观察。

二、生物素-链霉亲和素的制备生物素-链霉亲和素通常通过化学合成的方式进行制备。

首先需要合成生物素分子和链霉亲和素分子，然后将两者进行反应结合，得到生物素-链霉亲和素复合物。

制备好的生物素-链霉亲和素可以在实验室中用于各种生物标记的研究工作。

三、生物素-链霉亲和素的特性1. 高亲和力：生物素和链霉亲和素之间的结合具有较高的亲和力，能够稳定地结合在一起，确保标记物在实验过程中不会轻易分离。

2. 显著荧光特性：生物素-链霉亲和素复合物具有明显的荧光特性，可以在适当的荧光激发条件下发出强烈的荧光信号，便于实验者进行观察和测量。

3. 稳定性：生物素-链霉亲和素复合物在适当的条件下具有良好的稳定性，可以在实验室中长时间保存和使用。

四、生物素-链霉亲和素在生物学研究中的应用1. 蛋白质标记：生物素-链霉亲和素可以用于标记目标蛋白质，通过观察蛋白质的荧光信号，可以研究蛋白质在细胞中的表达和定位等信息。

2. 细胞标记：生物素-链霉亲和素可以用于标记细胞膜表面的生物分子，有助于研究细胞相互作用和信号传导等生物学过程。

3. 分子探针：生物素-链霉亲和素作为一种标记物，可以用于研究分子间的相互作用和结构等相关信息。

4. 荧光显微镜：生物素-链霉亲和素标记的细胞和分子可以在荧光显微镜下观察，进一步拓展了荧光显微镜技术在生物学研究中的应用。

五、结语生物素-链霉亲和素作为一种荧光标记物，在生物学研究中发挥着重要的作用。

它具有高亲和力、显著的荧光特性和良好的稳定性，能够在生物标记的实验中提供可靠的信号和结果。

生物素-亲和素


该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。
5. BA -组织化学技术
利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面， 使其更利于观察， 提高了检测灵敏度。 Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤
性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生 物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素 （BCHZ）。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白， 它由四个相同的氨基酸亚基组成， 亚基之间通过二硫键连接，亲和素 的每一个亚基含有一个与生物素结 合的位点，并与生物素或其衍生物 形成高度稳定的复合物。
1. BA-酶免疫技术
原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再 将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔
内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，
能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
优点
生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其 他活性。 生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育 和各种洗涤过程中脱落。 每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
۞ Morag
G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入 生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。 用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。

生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析


4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
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可标记AV/SA的物质：酶、抗原或抗体、铁蛋白、
胶体金、125I、异硫氰酸荧光素（FITC）等。

HRP-AV(SA)（酶标记蛋白的直接标记法）：
过碘酸钠法、戊二醛法。 ABC/SABC ：通过与生物素化酶复合物中的 生物素结合，间接地与酶形成结合物。
AV(SA)+B-HRP/ALP comlplex) /ABAP ABC(avidin-biotin-peroxidase

将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR (immuno-PCR)用于抗原的检测
如DNA· B-SA· ProA-IgG-Ag, Ag和DNA间建立对应关系，从而将对蛋白质的检 测转化为对核酸的检测，抗原抗体反应的特异性与PCR技术的高度敏感性 相结合，其检测灵敏度可达10-21mol水平，是迄今最敏感的分析方法。
B· * E A A-B· E（酶因活性中心受空间位阻作用而失活）
Ag·Ab Ag· A Ag· E A-B· （酶活性降低 反应系统： B· * 、Ag· E A、Ab（限量）、标准Ag/待检Ag Ag· A和待检Ag竞争结合限量Ab，若Ag ） 酶活性变化与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。
三、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术可明显提高方法的灵敏度 和特异性，通常采用BA法，即用荧光素直接标 记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲 合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生 物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法） 或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体 的夹心法。
BAS用于时间分辨荧光免疫分析也可以将反应信 号放大。
小 结

生物素—亲合素（链霉亲合素）系统具有的 多级放大独特效应，可极大地提高分析测定 的灵敏度；二者之间的高亲和、高特异结合 以及既可偶联生物大分子，又可连接标记材 料的特性，使该系统在标记免疫分析技术领 域中的应用具有很强的稳定性和适用性。该 系统有二种基本类型：以游离亲合素为中间 物，分别连接包含生物素化大分子的待检反 应体系和标记生物素的BAB法或ABC技术；另 一类是直接用标记亲合素连接生物素化大分 子反应体系进行检测的BA法或LAB。此外， 按生物素化第一抗体或生物素化第二抗体， 又分为直接法或间接法BAS系统。
第三节 生物素-亲合素系统(BAS)的特点
适用性广泛：BAS的多级放大作用，以及既可
偶联生物大分子，又可连接标记材料，使BAS不 仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测 及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各 类反应体系中反应物的分离、纯化。
其他：可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；
反应试剂可高度稀释，特别是与一抗偶联使用可 大幅减少一抗用量，降低实验成本；实验所需时 间不长。
标记蛋白质巯基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
生物素 N-羟基丁二酰胺
碳二亚胺 生物素羟 基琥珀酰 亚胺酯 (BNHS)
BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸（碱性AA）的氨基形成肽键
BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质
生物素分子量小，当与抗体或酶形成 生物素标记结合物后，由于大分子蛋白 的空间位阻效应，可对生物素与亲和素 的结合以及BAS的应用效果造成干扰。
如何减小空间位阻
长臂活化生物素（BCNHS）：
生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个 6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素 与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素 的活性作用。
标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后，
结构 PI 结合位 生物素 Ka 活性 四亚基糖蛋白 10.5 色氨酸 4 1015 13～15U
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18U
SA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合
远低于AV，因此目前以SA标记的酶结合物更为常用 。
二、亲合素/链霉亲合素的标记
思考题
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
9. 10.
生物素的分子结构特点是什么？ 生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？ 亲合素或链霉亲合素的分子结构、理化性质有何特点？ 为什么亲合素、链霉亲合素具有“桥联”作用？ 亲合素、链霉亲合素可以被哪些示踪剂标记？ 为什么生物素－亲合素系统具有放大作用？ 生物素与亲合素或链霉亲合素的结合是否与抗原抗体结合相同？ 生物素－亲合素系统放大的是反应过程还是单一检测信号？ 生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标记免疫技术联接？ 如何将生物素－链霉亲合素放大系统用于所有双位点ELISA?

生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP）
作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法（DNase I和DNA 聚合酶I）掺入到双链DNA中。

BNHS和BHZ
可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。
目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。
二、活化生物素标记蛋白质
特性：

活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性（是BAS多级放 大作用的物质基础）；

BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质, BHZ则多标记微 酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；

可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；
注意事项：

选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；

控制生物素：蛋白质比例
生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；
BA
生物素（biotin）、亲和素（ avidin）是一对具有高度亲和 力的物质，结合迅速、专一、 稳定并具有多级放大效应。 BAB
ABC
第一节
生物素理化性质与标记
I环为咪唑酮环，可与亲合 素结合 Ⅱ环为噻吩环， C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大 分子的唯一结构
生物素（维生素H） 动、植物组织中广泛 分布,卵黄和肝含量高 分子量小，244.31 D
四、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
五、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用

以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化
第三节 生物素-亲合素系统(BAS)的特点 灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/
抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同 时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此 ，BAS具有多级放大作用，反应的灵敏度高。
稳定性高和特异性强：AV/SA与生物素结合的亲
和常数比抗原-抗体反应至少高1万倍，二者的结合呈高度专一 性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以 及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，BAS稳定性高 ，特异性强。
第四节 生物素-亲合素系统的应 用
生物素与亲合素之间结合的亲合 力高、特异性强，各自均可以与各型 大小分子结合，以及二者在结合反应 时具有的多级放大作用等优越性，使 BAS及其相关技术被广泛应用在各种标 记免疫分析技术领域中，尤其为标记 免疫检测自动化分析做出了极大的贡 献。
一、生物素-亲合素系统基本类型 及原理
再与无水肼反应而成。
除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)： 能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
标记核酸的活化生物素

光生物素(photobiotin)光敏物质
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香基硝 基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针，用于 DNA或RNA的标记。

在生物素—亲合素（链霉亲合素）放大系统应 用中，无论采用酶、荧光素或发光物作为检测 示踪剂，均是待测抗原与生物素化抗体反应形 成复合物后，再利用生物素与亲合素间的多价 放大结合特性，或直接与标有示踪剂的生物素 结合（BA、LAB法），或依次与亲合素（链霉 亲合素）、生物素示踪标记物反应连接成聚合 物（BAB、ABC法），最终使待测反应信号被放 大，提高检测方法的灵敏度。
Ag-Ab· B-A/SA· E
特点：以A· · E/SA E代替BAB法中的A/SA，省却了加B· E的步骤
3.
ABC法
⑴ ⑵ A+B· E Ag+B· Ab A- B· E----ABC Ag-Ab· B
ABC
Ag-Ab· B-ABC
特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物 ABC,网络了大量酶分子，使该法的检测灵敏
BAB法：
Ag+B· Ab
Ag-Ab· B
A/SA
Ag-Ab· B-A/SA

B· E
Ag-Ab· B-A/SA-B· E
特点：以游离A/SA分别连接B-Ab和B-E
BA法，也称标记亲合素-生物素法: （labeled avidin-biotin,LAB） Ag+B· Ab Ag-Ab· B
A· E/SA· E

使用交联臂减少空间阻力
第二节 亲合素、链霉亲合素的理 化性质与标记
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素
(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合
物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所
有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链
酶亲合素（SA）结合。